1.1.3. Потенциалы и трансмембранные токи при возбуждении

Потенциал действия. Потенциал действия (ПД), или потенциал возбуждения нервных клеток (волокон), возникает в ответ на достаточное по силе раздражение. ПД — очень быстрый, кратковременный электрический процесс, поэтому для его регистрации необходим катодный осциллограф с широкополосным усилителем.

Классическое исследование параметров и механизма ПД проделано на гигантском аксоне кальмара с внутриклеточным раздражением и отведением внутриклеточного потенциала (рис. 1.16). В это нервное волокно (диаметром 0,5—1 мм) вводили на всю его длину два тончайших проволочных электрода. Один из них был раздражающим: через него в волокно подавали толчки тока того или иного направления, другой регистрировал электрический потенциал. При подаче короткого и слабого толчка выходящего тока (его направление определяют для положительных зарядов) внутриклеточный электрод регистрировал кратковременное падение МП, по форме и силе соответствующее толчку тока, но со сглаженными передний и задним фронтами, что определяется емкостью мембраны. Это так называемый электротонический потенциал (ЭП).

При подаче несколько более сильного толчка выходящего тока возникает эффект подпорогового раздражения: к электротоническому потенциалу присоединяется дополнительная деполяризация, называемая подпороговым, или локальным, ответом (ЛО).

Рис. 1.16 Основные электрофизиологические феномены в нервном волокне Аэт — анаэлектротон, КУД — критический уровень деполяризации, Кэт — катэлектротон, ЛО — локальный (подпороговый активный) ответ, МПП — мембранный потенциал покоя, ПД — потенциал действия, СП (отр и пол) — следовые потенциалы отрицательный и положительный (временные соотношения пика ПД и СП не выдержаны; отрицательный СП и особенно положительный СП значительно длительнее).

Локальным он называется потому, что и в экспериментальных, и в естественных уровнях этот потенциал не распространяется далеко. При усилении стимула и достижении порога раздражения, т. е. критического уровня деполяризации (КУД), возникает потенциал действия (рис. 1.16). При толчке входящего тока любой величины образуется только электротонический потенциал.

В потенциале действия различают пик (спайк) и следовые потенциалы.

Пик ПД представляет собой кратковременную инверсию внутриклеточного потенциала. Он имеет очень быструю восходящую фазу и несколько более медленный спад. Общая длительность пика в данном объекте составляет около 3 мс; амплитуда пика 110 мВ, т. е. превышает МПП (70 мВ) на 40 мВ. Эту разницу называют овершутом (от англ. overshoot — перелет). Вслед за пиком ПД регистрируются значительно более слабые и длительные отрицательный и далее положительный следовой потенциалы.

Потенциал действия имеет стандартные амплитуду и временнаые параметры, не зависящие от силы. стимула, вызвавшего данный ПД (правило «все или ничего»).

При раздражении гигантского аксона выходящим током через проволочный электрод, введенный на всю длину волокна, все точки этого нервного проводника раздражаются практически равномерно, так что в них одновременно возникает и развивается ПД. Такой ПД, по существу, не распространяется и называется мембранным. В естественных условиях ПД возникает локально, а затем распространяется (проводится) вдоль волокна. Это распространяющийся ПД. Мембранный ПД более удобен для анализа. (В миелинизированных волокнах мембранный ПД получают при работе на изолированном одиночном перехвате Ранвье.)

Потенциал действия — это электрический феномен, возникающий на плазматической мембране. Практически нормальный ПД возникает и в перфузируемом гигантском аксоне, лишенном аксоплазмы, при электрической стимуляции его мембраны.

Механизм потенциала действия. Причиной развития ПД является вызываемое критической деполяризацией мембраны открытие ее натриевых и калиевых каналов. Каналы, открываемые электрическим стимулом, называют потенциалозависимыми.

Открытие потенциалозависимых каналов приводит к пассивному движению соответствующих ионов по их электрохимическим градиентам.

Вход ионов Na⁺ в волокно обеспечивает восходящую фазу пика ПД, т. е. деполяризацию и инверсию потенциала на мембране, а несколько запаздывающий выход ионов K⁺ участвует в создании нисходящей фазы пика — реполяризации.

При развитии пика ПД отношение Р_K : Р_Nа :p_ci становится 1 : 20 : 0,45 (в покое оно составляет 1 : 0,04 : 0,45). Связь развития пика ПД с током Na⁺ доказывается прямой зависимостью амплитуды ПД от электрохимического градиента Na⁺ на мембране и достоверным переходом меченого ²⁴Na из среды в волокно при его возбуждении, причем в количестве, пропорциональном числу ПД. Связь нисходящей фазы ПД с током К⁺ доказывается зависимостью хода этой фазы от электрохимического градиента К⁺ на мембране.

Подробный анализ изменений мембранной проницаемости для ионов Na⁺ и К+ основанный на измерениях токов этих ионов, стал возможным благодаря использованию методики фиксации (кламп) (от англ. clump — связка, комок) электрического потенциала мембраны. В обычных условиях мембранные токи (при данных концентрационных градиентах) зависят и от ионной проницаемости (Р_Nа,_K), и от мембранного потенциала (МП). Мембранные токи могут точно характеризовать изменения Р_Nа, к только при постоянном МП.

Для фиксации мембранного потенциала мембрана гигантского волокна (или какой—либо иной клетки) с помощью внутриклеточного и наружного электродов соединяется со специальной электронной схемой (рис. 1.17). Основной частью этой схемы является дифференциальный усилитель, сравнивающий МП с задаваемым от постороннего источника потенциалом Е. Ток I на выходе усилителя определяется по направлению и значению разностью (Е — МП), подаваемой на вход усилителя. Этот ток протекает через мембрану и создает на ней дополнительный скачок потенциала, который уменьшает абсолютную величину разности (Е — МП). При большом коэффициенте усиления дифференциального усилителя и малой величине R в цепи, подводящей ток, компенсирующий скачок потенциала на мембране может быть весьма приближен по величине к (Е — МП), так что в итоге МП может стать приблизительно равным Е.

В этой ситуации при достаточном быстродействии системы (при ее постоянной времени τ < 20 мкс) любое, даже слабое случайное смещение МП немедленно компенсируется. Таким образом, МП фиксируется на величине Е и вместе с тем управляется путем изменения этой величины Е. Методика фиксации потенциала на мембране исключает любые смещения МП, в том числе потенциалы действия. Но она позволяет регистрировать и исследовать трансмембранные токи, возникающие при искусственном изменении МП. При фиксированной величине МП эти токи пропорциональны изменениям Р_Na и Р_K.

Если фиксированный МП равен потенциалу покоя, то трансмембранного тока практически нет. Если МП скачкообразно повышают, то возникает только направленный внутрь очень краткий ток дозарядки мембранной емкости и за ним постоянный ток утечки. Но если МП скачком снижают, то вслед за током разряда мембранной емкости на фоне тока утечки, направленного наружу, дополнительно возникает краткий, быстрый ток внутрь и за ним более длительный медленный ток наружу. Последние два тока — это ионные токи, текущие через натриевые и калиевые каналы, которые открываются с помощью деполяризации.

При устранении натриевого градиента на мембране путем замены части Nа⁺ на холин или доведения МП до величины Е = Е_Na картина преобразуется:

исчезает быстрый, направленный внутрь ток и выявляется в неосложненном виде медленный ток, направленный наружу. Того же можно добиться специфической блокадой натриевых каналов, применив тетродотоксин (ТТХ).

Таким образом, быстрый направленный внутрь ток — это натриевый ток. Картина его развития может быть получена путем геометрического

 

Рис. 1.17  Методика фиксации мембранного потенциала (МП) и регистрации трансмембранных токов (Iм) Ус — усилитель, реагирующий выходным током на разность между задаваемым «извне» потенциалом Е и МП. В силу конструкции системы ток I этого усилителя, проходя через сопротивление мембраны (Rм) изменяет МП так, что достигается равенство между МП и Е. При достаточном коэффициенте усиления усилителя и быстродействии системы МП практически фиксируется на уровне Е. При снижении Е и вслед за ним МП до КУД или более в мембране нервного волокна (кальмара) открываются потенциалозависимые натриевые и калиевые каналы, что порождает трансмембранные токи, которые и регистрируются на фоне поддерживаемого сниженного МП.

вычитания медленного ионного тока из суммарного (см. рис. 1.17). Натриевый ток пропорционален натриевому электрохимическому градиенту и натриевой проницаемости (P_Na). Медленный (задержанный) ионный ток — это калиевый ток. Его значение пропорционально калиевому электрохимическому градиенту и рк. Установлено, что этот ток устраняется блокадой калиевых каналов тетраэтиламмонием (ТЭА), прилагаемым снаружи.

Быстрый входящий i_na и медленный выходящий I_K возникают практически одновременно, но I_Na быстрее развивается, достигая своего «потолка». Если МП возвращается к величине, характерной для покоя, то I_Na исчезает примерно в 10 раз быстрее, чем I_K т. е. в массе натриевые каналы мембраны и активируются (деполяризацией), и деактивируются (реполяризацией) быстрее, чем калиевые.

Активация, деактивация и инактивация ионных каналов. Активация каналов определяется открытием их активационных ворот (соответствующим изменением конформации неких макромолекул), а деактивация — закрытием этих же ворот.

Возвращаясь к картине развития I_Na и I_K длительной деполяризации (см. рис. 1.17) в условиях клампа, необходимо обратить внимание на то, что I_Na уже через 5 мс исчезает, несмотря на деполяризованное состояние мембраны (I_k при этом сохраняется).

Этот феномен называют инактивацией натриевых каналов. Его связывают с закрытием специальных инактивационных ворот в натриевых каналах. То, что здесь действительно существует специальный макромолекулярный механизм, доказано избирательным нарушением инактивации P_Na под  влиянием фермента проназы. Схема срабатывания активационных ворот натриевых каналов, а также их инактивационных ворот при разных МП приведена на рис. 1.18.

Инактивация натриевых каналов, т. е. закрытие их инактивационных ворот, развивается вследствие деполяризации, как и активация, но позже, что

Рис. 1.18 Работа ворот потенциалозависимых натриевых каналов мембраны А — зависимость процента открытых h— и т— ворот от мембранного потенциала (МП); Б — положение т— и h—ворот при покое (J), развитии пика ПД (II) и рефрактерности (III): т — активационные ворота, h — инактивациониые ворота, φ — потенциал, при котором открыты м—ворота у 50% каналов.

и делает возможным развитие I_Na (a значит, и ПД в естественных условиях). Инактивация Р_Na — очень важный механизм, который способствует прекращению пика ПД, развитию временной невозбудимости — рефрактерности. Инактивация Na—каналов устраняется после реполяризации мембраны.

Ионные токи при развитии потенциала действия. Ионные токи формируют фазы пика ПД. Эти токи в общем сходны с токами, получаемыми при критической деполяризации в методике клампа, но развиваются и прекращаются они гораздо быстрее.

В процессе развития ПД действуют многие факторы, связанные прямыми и обратными связями. Например, на восходящей фазе ПД действует система факторов с положительной обратной связью (отмечена знаком «+»).

Здесь деполяризация увеличивает Р_Nа, а последняя порождает I_Na, усиливающий деполяризацию (пока и поскольку I_Na больше I_k + I_y). В силу этих отношений I_Na и восходящая фаза ПД развиваются с ускорением, а амплитуда ПД быстро достигает некоторого максимума, более или менее  приближенного к Е_Na.

На спаде ПД при реполяризации для I_Na действует та же   система факторов, но с обратными знаками эффектов, а для  калиевого тока — система факторов с отрицательной обратной связью (отмечена знаком «—»).   В итоге спад I_K несколько затягивается.

Если скрупулезно учесть все эти факторы и их взаимодействие, то можно из значения токов, получаемых при фиксации мембранного потенциала на разных уровнях, рассчитать форму нормального ПД. Показано совпадение расчетных параметров ПД и показателей ПД, регистрируемых в опыте.

Взаимодействие некоторых из этих факторов можно наглядно представить эквивалентной схемой (см. рис. 1.8, В).

Отрицательный следовой потенциал связан с остаточным I_Na и с накоплением К⁺ в межклеточных щелях; положительный следовой потенциал — с остаточным I_K но главным образом с электрогенной работой натрий—калиевого насоса мембраны, активизируемого накоплением Na⁺ под мембраной (из—за I_Na ПД), а К⁺ — в межклеточных щелях. В некоторых нервных клетках сразу вслед за пиком развивается довольно значительный краткий положительный следовой потенциал. Его называют андершут (от англ. undershoot — недолет), он создается остаточным I_K.

Расход ионов на пик одного проводящегося ПД в гигантском аксоне кальмара очень мал. Например, расход внутриаксонального К⁺ при этом приблизительно равен одной миллионной доле внутреннего калиевого запаса.

Пик ПД — весьма экономичный сигнал, практически не нарушающий ионных градиентов на мембране, энергией которых он питается.

Ионные градиенты на мембране — это «пружина», энергии которой может хватить на 5—10⁵ ПД без подзарядки. Но для длительной работы волокна ионные градиенты нужно восстанавливать, что и обеспечивает работа натрий—калиевого насоса мембраны.

Рассмотрим подпороговый локальный ответ (ЛО) в нервном волокне. Этот ответ обладает в основном тем же механизмом, что и ПД. Его восходящая фаза определяется входящим I_Na, а нисходящая — выходящим I_K. Однако амплитуда ЛО (и его натриевый ток) пропорциональна силе подпорогового раздражения, а не стандартна, как у ПД, т. е. не подчиняется правилу «все или ничего».

 

Особенности потенциалов действия в соме нейрона. Необходимо остановиться на некоторых особенностях потенциалов действия в телах нейронов, подробно исследованных у моллюсков. Тела гигантских нейронов брюхоногих моллюсков — крупные образования, не имеющие на себе синапсов (синапсы у них находятся на так называемом центральном отростке). Большие размеры и однородность поверхности этих нейронов позволяют подробно исследовать электрические явления на их мембране. На препарате соматической мембраны при электрическом раздражении могут быть получены полноценные ПД. Удалось осуществить фиксацию потенциала такой мембраны, изучить трансмембранные токи при ее активации.

Мембранный потенциал покоя сомы невелик (—40, —50 мВ); потенциал действия имеет овершут и достигает 100 мВ и более, по форме он схож и аксонным. Однако ионные механизмы ПД мембраны сомы нейрона моллюска имеют существенные отличия от известных механизмов для нервных волокон. Главное отличие состоит в том, что ПД здесь генерируется не только за счет входящего I_Na (как в аксоне), но и за счет входящего I_Ca.

В соматической мембране нейронов находятся специальные кальциевые каналы, открываемые деполяризацией.

Ток ионов Са²⁺ через них осуществляется по электрохимическому градиенту. Эти каналы не блокируются ТТХ, но инактивируются кобальтом, верапамилом и препаратом D—600.

Кальциевый ток развивается медленнее натриевого и гораздо медленнее инактивируется (много секунд!). Значение этого тока даже при сохранении высокого концентрационного градиента Са²⁺ чрезвычайно зависит от внутренней концентрации Са²⁺. Этот ток полностью подавляется (инактивируется), если (Са²⁺)вн =5,8 •10^—8 моль/л. При (Са²⁺)вн = 5,8 • 10^—9 моль/л открываемая деполяризацией кальциевая проводимость максимальна. При обычных для среды значениях (Са²⁺)нар в этих условиях Е_Ca приблизительно равен +130 или даже + 200 мВ.

Особенности ионных каналов соматической мембраны, вероятно, имеют значение не только для электрогенеза. Можно думать, что они существенны и для обеспечения интенсивно протекающих в соме метаболических реакций, чувствительных к (Са²⁺)вн.

Шумы ионных каналов. Каждый из ионных каналов мембраны, обладающих воротными механизмами, даже при постоянстве МП и химического состава среды не находится постоянно в однотипном положении: он то открывается, то закрывается. Эти переходы от закрытого состояния к открытому и обратно осуществляются по закону случая.                     

Хаотическое открытие и закрытие каналов, порождающее перемещение ионов, создает электрический шум. Для потенциалозависимых каналов соответствующее электрическое поле является фактором, резко увеличивающим вероятность их открытого состояния, что и создает эффект увеличения ионной проницаемости.

При исследовании динамики каналов определенного вида изучают электрический шум, создаваемый этими каналами в некотором небольшом участке мембраны в условиях фиксации МП и химической блокады прочих каналов. Например, в мембране гигантского аксона кальмара таким способом изучили шумы раздельно натриевых и калиевых каналов. Анализ этих шумов позволил рассчитать плотность расположения каналов в мембране и проводимость одиночного канала. Так, в гигантском аксоне кальмара плотность натриевых каналов оказалась равной 300 на 1 мкм², средняя электрическая проводимость—  

Рис. 1.19                       Методика фиксации потенциала в малом «лоскуте» мембраны (пэч—кламп) (от англ. patch — лоскут, клочок) Исследуемый участок мембраны ограничен краями кончика прилипшей к мембране микропипетки (микроэлектрода). Клетка(обозначена пунктиром) при этом может быть  удалена (А). Если в исследуемом участке мембраны на короткое время открывается один натриевый канал, то его  ток имеет относительно простую прямоугольную форму (Б).

 

                           

4 пСм (пСм (р8) — пикосименс; сименс — величина, обратная ому). В перехвате Ранвье амфибий плотность натриевых каналов 2000 на 1 мкм², а средняя проводимость канала равна 8 пСм.

При фиксации потенциала в изолированном очень малом участке мембраны удается регистрировать и токи одного канала (рис. 1.19). Так были обнаружены, например, токи одиночного натриевого канала и токи одиночного кальциевого канала. Эти токи имеют прямоугольную форму. Типичная плавная форма ПД является результатом неодновременного открытия и закрытия массы каналов.