1.3.1. Поступление предшественников секрета в клетку

Предшественники секретируемого вещества поступают в секреторную клетку благодаря специфическим и неспецифическим механизмам трансмембранного транспорта и эндоцитоза. Помимо потребностей секреторного процесса, эти механизмы в разной мере используются для регуляции объема клетки, осмотического давления, внутриклеточного рН и электрогенеза на уровне клеточных мембран.

Трансмембранный транспорт. В разных типах секреторных клеток природа секретируемого вещества обусловливает поступление в клетку определенных мономеров, субстратов окисления и окислителей и, соответственно, преобладание в клеточной мембране необходимых транспортеров. Глюкоза из—за повышенной гидрофильности молекулы переносится через мембрану с помощью специальных транспортеров Glut (Glucosa transporter).

Эти транспортеры различаются по числу молекул глюкозы, переносимых за один цикл, чувствительности к лиганду, активирующему их деятельность, и к Na⁺ Так, наиболее распространенный Glut—1 переносит за один рабочий цикл в клетку одну молекулу глюкозы или галактозы, маннозу, 2—деоксиглюкозу

или З—О—метилглюкозу по осмотическому градиенту, регулируя внутриклеточное осмотическое давление и энергетический метаболизм. Транспортер работает Nа⁺—независимо и активируется многими гормонами гипофиза с пролиферативной функцией. Инсулин—активируемый Glut—4 транспортирует 4 молекулы глюкозы, a Glut—5 переносит через мембрану фруктозу. В разных участках мембраны одной клетки могут встраиваться разные транспортеры гексоз.

Глюкоза может поступать в клетку и Na⁺—зависимо с помощью котранспортера Na⁺/глюкоза, а также через Na⁺/K⁺—АТФазу. Сопряженный транспорт натрия и глюкозы объясняется высокой осмофильностью обоих веществ, что позволяет с помощью котранспорта быстро гомеостатировать осмотическое давление в клетке, а для стабилизации этого параметра используется «осмонейтральный» транспорт веществ через Na⁺/K⁺—АТФазу.

Транспорт липидов внеклеточно осуществляется белками, в том числе и альбуминами. Через клеточную мембрану жирные кислоты могут поступать диффузионно («flip—flop») (Буквально — сальто—мортале). При связывании альбумина с его рецептором, встроенным во внешнюю поверхность мембраны, разобщение жирных кислот и носителя облегчается, что способствует процессу пассивной диффузии (рис. 1.73).

Поступающие в цитоплазму жирные кислоты соединяются со специфичными для них транспортными белками. Последние также могут быть встроены в клеточную мембрану, облегчая сам процесс диффузии липидов передачей. Внутримембранные транспортеры быстро осуществляют трансмембранный перенос жирных кислот.

В цитоплазме многих типов секреторных клеток выделены специфические для разных классов липидов (фосфолипидов, ретиноидов и др.) транспортеры, переносящие их между разными компартментами (От англ. compartment — отделение, отсек)

Однако вопрос об участии таких транспортеров в переносе соответствующих липидов через клеточную мембрану в ряде случаев остается открытым. Известно, что липопротеины низкой плотности плазмы крови могут поступать в клетки эндотелия и путем рецепторного эндоцитоза (рис. 1.74).

Рис. 1.73 Системы трансмембранного переноса липидов

А — облегченная диффузия при взаимодействии носителя (альбумина — АЛБ) жирных кислот с его рецептором (Ралб) или (Б) с белком, связывающим жирные кислоты (ЖК—СБ); В — внутримембранный транспортер, связывающий внеклеточно носитель жирных кислот, а внутриклеточно — ЖК—СБ.

Рис. 1.74 Схема образования и судьбы секреторных гранул, согласно которой после образования в аппарате Гольджи секреторные гранулы (пузырьки) транспортируются к месту выделения

После экзоцитоза могут образовываться новые пузырьки путем эндоцитоза, возможно, за счет использования той же мембраны, из которой состояли первые пузырьки. 1 — аппарат Гольджи, 2 — цистерны Гольджи, 3 — конденсирующая вакуоль, 4 — секреторная гранула, 5 — экзоцитоз, в — эндоцитоз, 7 — окаймленные пузырьки, 8 — гладкие микропузырьки, 9— лизосома 10— гранулярный эндоплазматический ретикулум.

Рис. 1.75 Переносчики основных нейротрансмиттеров в мембране нейрона

Рис. 1.76 Механизм секреции электролитов клетками поджелудочной железы

Аминокислоты в соответствии с основной, кислотной или амфифильной структурой молекул транспортируются через мембрану специфическими типами транспортеров, работающими Nа⁺—зависимо или независимо, а также через поры некоторых помп. Так, представители ЕААС—1 (Exitatory Amine Acid Carrier—1) семейства высокоаффинных Na⁺/K⁺—зависимых транспортеров глутамина и аспарагина выделены в клеточной мембране нейронов, энтероцитов кишки, гепатоцитов, в сердце и легких. Сходные транспортеры для глутамина описаны в глиоцитах (GLAST, GLT—1). Другое суперсемейство для транспортеров нейтральных и двуосновных аминокислот включает Nа⁺/зависимые и Na⁺/—независимые переносчики. Одним из них является D² для цистеина. Апо—липопротеин В—100 (ароВ—100) осуществляет транспорт основных аминокислот лизина и аргинина и других веществ. В поступлении в клетку пептидов, белков и других веществ участвуют различные АВС—АТФазы (ATP—Binding Cassette transporting proteins). В настоящее время у про— и эукариот описано более 100 АВС—помп, имеющих высококонсервативную доменную (От франц. domaine — владение, область, сфера).

организацию (области однородной среды, отличающиеся упорядоченностью в расположении или ориентации частиц) и большую гомологию молекулярных структур. Во многих случаях показано, что они сочетают свойства транспортера и канала, поскольку через образуемую субъединицами пору в клетку и из нее могут проходить различные вещества. В их числе Сl^—, тяжелые металлы, сахара, антиканцерогены, олигопептиды и белки. Среди помп существует определенная «специализация»: RING 4—11 осуществляет АТФ—зависимый транспорт пептидов, MDRP3 — наркотических веществ, MDRP1 — органических веществ и ионов хлора. В настоящее время эти транспортеры — предмет пристального внимания ученых, поскольку мутации генов некоторых из них приводят к тяжелым патологиям.

Специфические транспортеры трансмиттеров (медиаторов), обеспечивающие их возврат в пресинаптическое окончание нейрита, описаны для ГАМК, дофамина, норадреналина, серотонина (рис. 1.75). Локализованы они также в клеточной и везикулярных мембранах хромаффинных и других секреторных

клеток, где способствуют накоплению выводимых веществ в экзоцитозных пузырьках в обмен на выход Н⁺. Все они являются интегральными белками с 12 трансмембранными доменами и работают Na⁺— и С1^——зависимо, что указывает на их осмочувствительность.

В целом направленность переноса органических веществ определяется трансмембранными электрохимическими градиентами Na⁺ (K⁺ у беспозвоночных) и Н⁺. На апикальной мембране поляризованных эпителиальных клеток градиент Na⁺ направленный в клетку, создается благодаря работе Nа⁺/К⁺—АТФаз базолатеральной мембраны, выводящих ионы. Затем включаются Na—зависимые вторичные транспортеры. Преобладание К—зависимого транспорта и электрогенеза у насекомых, по сравнению с преимущественно Na—зависимостью процессов у позвоночных, может иметь эволюционное значение в силу большей химической активности Na⁺ по сравнению с К⁺. Электрохимический градиент H⁺ на уровне плазмалеммы и внутриклеточных мембран фагоцитов, остеокластов и многих «богатых митохондриями» эпителиальных клеток животных создается Н⁺/АТФазами. Это способствует запуску различных транспортеров, в том числе и Nа⁺/независимых (рис. 1.76).

Эндоцитоз. В секреторную клетку вещества могут поступать одномоментно в больших, чем это могут обеспечить обменники, помпы и каналы, количествах, используя эндоцитоз. Известны два основных механизма эндоцитоза:

неспецифический жидкофазный и рецепторный.

Жидкофазный эндоцитоз представлен макро— и микропиноцитозом, усиленной диффузией. Наиболее часто жидкофазный эндоцитоз используется в условиях гиперосмолярности внеклеточной среды, вызывающей выход воды из клетки и значительное уменьшение ее объема. Поступление значимых объемов воды или осмотически активных веществ в процессе жидкофазного эндоцитоза можно рассматривать как механизм быстрой коррекции трансмембранного осмотического градиента (вплоть до изоосмотичности) и восстановления объёма клетки.

Рецепторный эндоцитоз регулируется преимущественно внеклеточным сигналом (лигандом) и имеет ряд отличий от жидкофазного эндоцитоза. Так, рецепторный эндоцитоз характеризуется селективностью веществ, поступающих в клетку, специфика которых определяется самой клеткой через синтезируемые в ней рецепторы клеточной мембраны. Кроме того, меньшие объемы веществ, поступающие в клетку, по сравнению, например, с макропиноцитозом, предопределяют большую роль направленной внутриклеточной сортировки входящих молекул и расширение круга их функций.

Различают следующие стадии рецепторного эндоцитоза: 1) связывание рецептора с лигандом; 2) образование «опушенных» клатриновых везикул; 3) ацидификация в эндосомах и преобразования лигандрецепторных комплексов;

4) сортировка эндоцитосом. Детально стадии рецепторного эндоцитоза были исследованы для рецепторов факторов роста, обладающих внутриклеточными доменами с протеинкиназной активностью. Считается, что только такие рецепторы, способные к аутофосфорилированию и фосфорилированию друг друга после связывания с молекулами лиганда (эпидермального фактора роста, например), участвуют в рецепторном эндоцитозе. Благодаря латеральной диффузии эти рецепторы скапливаются в складках клеточной мембраны, образуя рецепторные комплексы. Этим облегчается процесс их взаимного фосфорилирования после активации лигандом. Благодаря этому рецептор фосфорилирует по остаткам тирозина связанные с ним примембранные, эволюционно весьма консервативные, белки—адапторы (рис. 1.77). Последние фосфорилируют

Рис. 1.77 Образование эндоцитосомы

А — структура адаптера плазмалеммы (α— и β—субъединицы тяжелой цепи). Б — интернализация лиганд—рецепторных комплексов с помощью адапторов и клатрина: 1 — рецептор, 2 — адаптер, 3 — клатрин. Заштрихованы субъединицы легкой цепи.

ассоциированные с ними молекулы клатрина, тяжелые цепи которого представляют собой треногу. Это позволяет клатрину одновременно быть связанным с белком—адаптером, с ГТФ/ГДФ—связывающим белком динамином и белком теплового шока hsp 70. Молекула динамина на N—конце имеет 4 сайта (от англ. site — участок), связывания ГТФ, а на С—терминале — 3 сайта с остатками пролина, которые связываются с микротрубочками цитоскелета. Это облегчает транспортировку образовавшейся эндоцитосомы в аппарат Гольджи или к ядру с помощью hsp 70, присоединяющемуся к N—ацетилгликозаминовому сайту клатрина. Примембранный ацидоз способствует сборке клатриновой сетки эндосомы и, тем самым, рецепторному эндоцитозу.

По мере продвижения эндоцитосомы в ее мембрану встраиваются другие мономерные α—ГТФазы, обеспечивающие энергетику транспорта. Система за—кисления эндоцитосомы осуществляется Н⁺/АТФазой (в энтероцитах Н⁺—К⁺—АТФазой) и лизосомальной кислой фосфатазой, перешедшими в её мембрану с участком плазмалеммы. Поддерживает рН в эндосоме не ниже определенного уровня система буферирования, представленная встраивающимися в мембрану Ca⁺—Mg⁺—АТФазой и Са⁺—H⁺— обменником.

Ацидификация внеклеточного пространства у кавеолы является основным условием интернализации лиганд—рецепторных комплексов (и токсинов), а внутри эндоцитосомы — причиной их протеолиза. Возможны разные варианты в дальнейшем.

1. В ранних эндоцитосомах лиганд фрагментируется и поступает в цитоплазму, а рецептор возвращается в плазмалемму, где может подвергаться повторному эндоцитозу (ретроэндоцитоз) многократно, выполняя функцию шаттл—белка (от англ. — shuttle — челнок). Ретроэндоцитоз рецептора может сочетаться с транспортом целой молекулы лиганда в ядро в том случае, когда она имеет соответствующую сигнальную последовательность остатков аминокислот (например, пролактин в гепатоцитах).

2. При высокой концентрации лиганд—рецепторных комплексов лиганды в эндосоме также фрагментируются, а рецептор транспортируется к ядру, где способствует подавлению экспрессии собственного гена (генов), адаптируя число рецепторов к функциональному состоянию клетки.

3. В средних и, возможно, поздних эндоцитосомах, образующихся после слияния с лизосомами, протеолизу подвергаются и лиганд, и рецептор, — их фрагменты поступают в цитоплазму и/или ядро. Если слияние эндосомы с лизосомой произошло в аппарате Гольджи, тогда фрагменты лиганда могут использоваться в процессе сборки в цистернах Гольджи молекул секретируемого вещества и образования экзоцитозных везикул.

4. Эндоцитосома проходит путь от апикальной до базальной мембраны секреторной клетки (трансцитоз), лиганд—рецепторный комплекс протеолизу не подвергается, и лиганд выделяется. Возможен и ретроэндоцитоз такого комплекса без трансцитоза, тогда увеличивается доля примембранных эффектов.

Таким образом, для рецепторного эндоцитоза, в отличие от жидкофазного, регуляция внутриклеточного осмотического давления и объема клетки не является основной задачей.

Рецепторный эндоцитоз может способствовать ускорению и пролонгированию эффектов Внеклеточного лиганда на внутриклеточные структуры. Фрагменты лиганда могут использоваться для ускоренного синтеза секретируемого вещества или для интенсификации внутриклеточного метаболизма.

Регуляция и функции внутриклеточного рН. Значения внутриклеточного рН как интегрального показателя кислотно—щелочного равновесия играют большую роль в регуляции всех стадий секреторного процесса. Впервые зависимость внутриклеточного метаболизма и трансмембранного транспорта от градиента рН выявил Г. Сёренсен. Будучи специалистом в области электрохимии, он определил рН как отрицательный логарифм термодинамической активности протона: рН = —logH⁺. Г. Сёренсен впервые доказал, что рН отражает интегральную оценку обмена веществ и энергии в клетке. При этом кислоты и щелочи выступают в ролях соответственно доноров и акцепторов H⁺. В клетке чаще источником протона являются органические вещества (например, кислые аминокислоты, пептиды и белки). Разные клетки характеризуются специфическими базальными значениями рН. Так, в нейронах, в силу участия ионов щелочных металлов в электрогенезе, рН более щелочная (до 7,3), а в фагоцитирующих клетках — более кислая (до 6,5). В разных структурах одной клетки рН также может различаться: в большинстве клеток в митохондриях рН > 7, в аппарате Гольджи от 2 до 5, в лизосомах рН = 2, эндосомах рН =0,5—1,0 и фагосомах — 3—5 при рН > 5 для цитоплазмы. Поэтому органеллы с ацидозом рассматривают как депо Н⁺. Очевидно, что функциональное состояние клетки, в том числе и стадия секреторного процесса, могут обусловливать изменения рН и быть одновременно рН—зависимыми. На первой стадии секреторного процесса на значения рН может влиять трансмембранный транспорт воды и ионов.

Регуляция рН в секреторной клетке: транспорт воды. Направление трансмембранного транспорта воды (гидравлический градиент) противоположно подобному для осмотического градиента. Перенос молекул воды может быть диффузным или осуществляться через водные поры (каналы) с регулируемой проницаемостью для воды (рис. 1.78). Диффузия воды облегчена в участках клеточной мембраны, насыщенных анионными фосфолипидами, неполярные концы молекул которых расположены под углом друг к другу. Это увеличивает межмолекулярные пространства в мембране, через которые диффундирует вода.

Рис. 1.78 Движение воды и электролитов через межклеточное пространство

Водные поры образованы белками аквапоринами, образующими гомотетрамер с каналом в центре. Для аквапорина—2 в люминальной (от лат. lumen, luminis — свет, просвет)

(обращенной в полость органа) мембране эпителия мочевого пузыря амфибий и почечных канальцев млекопитающих показана способность связывать антидиуретический гормон (вазопрессин), что приводит к увеличению водной проницаемости и реабсорбции воды.

В мембране и по обе стороны от нее молекулы воды образуют гидратные оболочки ионов и органических молекул. Так, ионы натрия имеют три гидратные оболочки, хлора — две, а калия — одну, чем объясняется разная степень их влияния на внутриклеточные значения рН, осмотическое давление и соответствующие трансмембранные градиенты. Большая «гидратная агрессивность» ионов натрия, чем калия, определяет асимметрию их распределения по обе стороны клеточной мембраны: в клетке больше ионов калия, а во внеклеточном пространстве — натрия. Гидрофильные участки белков, пептидов и более сложных органических веществ также связывают воду. Однако в районе гидрофобных последовательностей молекул отталкиваемые молекулы воды образуют комплексы на определенном расстоянии от этого участка белка. В целом такой зеркальный «гидратный портрет—слепок» органической молекулы может играть важную роль в межмолекулярных взаимодействиях в мембране и примембранных пространствах, особенно в механизмах трансмембранного переноса по рН— и осмотическому градиентам.

Транспорт ионов: обменники, каналы, помпы. Частичный гидролиз воды в клетке с образованием Н⁺ и ОН^— обусловливает влияние трансмембранного переноса воды на регуляцию рН цитоплазмы и, через протонирование и гидроксилирование органических молекул, на изменение свойств последних. Повышенная гидрофильность ряда катионов сопряжена также с их ролью в трансмембранном переносе протонов. Так, с помощью Na⁺/K⁺ обменника, изоформы которого присутствуют в мембранах клеток всех живых организмов, начиная с бактерий, осуществляется разнонаправленный перенос иона натрия в обмен на протон (рис. 1.79). Энергетически он возможен благодаря наличию концентрационного градиента ионов, поэтому зависит от потенциала мембраны. Однако сами обменники представляют собой неэлектрогенные переносчики. Постоянно активный, изменяя лишь число циклов в единицу времени, Na⁺/H⁺ обменник быстро корректирует величины рН и осмотического давления по обе стороны мембраны. У млекопитающих натрий в обменнике может быть заменен Са²⁺ или К⁺.

Для регуляции рН в секреторной клетке особое значение имеет Са²⁺ как основной буфер ацидоза. Поэтому обменники Ca²⁺/H⁺, Са²⁺/2Н⁺ наиболее распространены в мембранах органелл — депо H⁺. При защелачивании цитоплазмы H⁺ выкачивается из депо в обмен на Са²⁺. Таким образом они превращаются перманентно в депо для Са²⁺.

В регуляции трансмембранных градиентов рН участвуют также обменники (рис. 1.80), переносящие катионы в обмен на анион (Nа⁺/НСОз^—, 2Cl^—/Ca²⁺), катиона на катион (Na⁺/Ca²⁺) или аниона на анион (Сl^—/НСОз^—). Возможен и однонаправленный транспорт ионов (симпорт, или котранспорт). В секреторных клетках представлены котранспортеры 2Cl^—/Na⁺/K⁺, Nа⁺/НСОз^—, Nа⁺/глюкоза и Nа⁺/лактат. Подчеркнем, что в обоих случаях (симпорт или антипорт) движение ионов происходит по концентрационному градиенту, электронейтрально и АТФ—независимо.

Рис. 1.79 Транспортные процессы в проксимальном извитом канальце

Ионные насосы показаны кругами и сплошными стрелками, межклеточный транспорт — штриховыми стрелками, субстрат — S*.

Рис. 1.80 Секреция обкладочными клетками желудка соляной кислоты, с активным транспортом ионов H⁺ и Сl^— через апикальную мембрану в просвет органа

Через каналы транспорт ионов осуществляется также по концентрационному градиенту и АТФ—независимо, но электрогенно. В секреторных клетках описано несколько типов катионных и анионных каналов, образуемых одним или несколькими интегральными белками, формирующими пору канала. Проницаемость каналов регулируется благодаря селективной (или смешанной) чувствительности этих белков к химическим, механическим факторам или к изменению потенциала мембраны.

К хемочувствительным относят ионные каналы, имеющие участки связывания гормонов или трансмиттеров (локализованные внеклеточно), H⁺ или Са²⁺ (внутриклеточно). Классическим примером является мономерный ГАМКa—рецептор клеточной мембраны, который после связывания молекулы ГАМК превращается в канал для С1^—, входящего в клетку по концентрационному градиенту и гиперполяризующего мембрану. В мембране саркоплазматического ретикулума скелетных мышц локализован один из каналов для Са²⁺ обладающий рецепцией к риноидину. Для связывания лиганда белки канала должны предварительно связать ионы кальция. Этот риноидин— и кальций—чувствительный канал для Са²⁺ относится к широко представленной в секреторных клетках большой группе кальций—чувствительных ионных каналов для Na⁺, K⁺, Сl^—, Са²⁺ Связывание ионов кальция в клетке определяет также роль белков этих ионных каналов в гомеостатировании внутриклеточного Са²⁺. Для рН—чувствительных ионных каналов характерно протонирование при внутриклеточном ацидозе участков молекул. Например, в этих услових запускается вход Na⁺ через Nа⁺/рН—чувствительные каналы, что способствует гомеостатированию рН цитоплазмы. Регуляция хемочувствительных ионных каналов может быть и опосредованной через структуры, активируемые связыванием рецептора с лигандом (например, ГТФ/ГДФ—связывающих белков).

Механочувствительные ионные каналы открываются при изменении степени натяжения клеточной мембраны. В секреторных клетках механочувствительные каналы для Са²⁺, Na⁺ Cl^— участвуют в регуляции объема клетки

Рис. 1.81 Секреция НСl обкладочной клеткой желудка: ионы Н⁺ переносятся в просвет органа при участии (H⁺/K⁺ )—АТФазы, встроенной в мембрану щеточной каймы. Ионы Сl^— также активно переносятся в просвет, а в клетку поступают в обмен на ионы НСО₃;ионы. Н⁺ образуются из Н₂СО₃ и в меньшей степени, из воды

и секреции. Примером может служить секреция атриального натрийуретического гормона миоэндокриноцитами ушек правого предсердия млекопитающих при его растяжении венозной кровью.

Потенциал—чувствительные каналы для всех ионов имеют гомологичный четвертый внутримембранный домен (S4) интегрального белка канала, связанный с механизмом открывания его ворот. Для S4 характерно присутствие заряженных и незаряженных участков. Предполагается, что при деполяризации мембраны последние приобретают положительный заряд, что является критическим для открывания потенциалчувствительных каналов, участвующих в генезе потенциала действия и выведении секрета. Заметим, что разные подтипы каналов могут открываться при разных значениях потенциала мембраны. Например, медленные каналы для К⁺ открываются при критических для генерации ПД значениях деполяризационного потенциала, другие, также выходящие, открываются при максимальной следовой гиперполяризации мембраны и закрываются по достижении КУД. В клетках пейсмекерного типа (водители ритма сердца, ЦНС, нейросекреторные клетки) такие каналы обеспечивают спонтанную повторяющуюся генерацию ПД. Это весьма важно для выведения больших количеств секрета белково—пептидной природы при запуске механизма «стимул—секреция».

Химические факторы могут регулировать проницаемость и потенциал—чувствительных ионных каналов. Так, жирные кислоты, особенно ненасыщенные, снижают проницаемость деполяризующих потенциал—зависимых Na⁺— и Са²⁺ каналов и увеличивают — входящих и гиперполяризующих мембрану потенциал—чувствительных К⁺/каналов.

Движение ионов против градиента концентрации требует энергетических затрат, на которые идет энергия, выделяющаяся при расщеплении молекул АТФ. С этим связано наличие энзиматических свойств у молекул транспортеров или помп (рис. 1.81). Среди них наиболее известна Nа⁺/К⁺—АТФаза, относящаяся к α/β гетеродимерным катион—обменным АТФазам (помпы Р—типа, как и Н⁺/К⁺—АТФаза). Она состоит из α— и β—субъединиц и обладает способностью присоединять и расщеплять АТФ, акцептировать и переносить катионы и ряд других веществ. На вынос 3Na⁺ из клетки и перенос 2K⁺ в клетку затрачивается 1 моль АТФ. Работая в базальном режиме, Nа⁺/К⁺—АТФаза поддерживает асимметрию катионов по обе стороны плазмалеммы. Когда она нарушается (например, во время генерации восходящей фазы ПД и следовой деполяризации), помпа активируется (в период следовой гиперполяризации) и восстанавливает соотношение катионов. В поляризованных секреторных клетках Nа⁺/Н⁺—обменник и Na⁺—каналы локализованы преимущественно в

Рис. 1.82 Зависимость пассивного переноса ионов от размера пор плотных контактов

апикальной мембране, а Na⁺/K⁺—АТФаза — в базальной. Это способствует поддержанию низкого уровня ионов натрия в клетке и, тем самым, созданию электрохимического градиента Na⁺ на апикальной мембране. В плазмалемме и в мембранах внутриклеточных структур секреторных клеток описаны и другие помпы:

Н⁺/К⁺—, Н⁺—, Ca²⁺—Mg²⁺—, 2H⁺/Ca²⁺— и I^——АТФазы. Среди них наиболее эволюционно древней считается протонная помпа, которая у гриба нейроспоры выкачивает протон из клетки, создавая мембранный потенциал в 200 мВ. У галобактерий гомологом Н⁺—АТФазы является галофильный белок, гомологичный родопсину. Он также способствует выходу протонов. Протон—секретирующие клетки широко представлены у разных групп животных (рис. 1.82).

Для секреторной клетки описанные механизмы транспорта ионов имеют особое значение. Сопряженно с переносом в клетку натрия активируется перенос глюкозы и ряда аминокислот. Через пору, образуемую субъединицами Nа^+/К⁺—АТФазы, в клетку поступают глюкоза, аминокислоты и до 40% всего объема кислорода, попадающего в клетку извне. Таким образом, предшественники—мономеры синтезируемого белка, субстрат окисления и окислитель, обеспечивающие энергетику синтеза и работу самой помпы, попадают в клетку сопряженно с транспортом ионов. Пассивный перенос через эпителий зависит также от размера пор плотных межклеточных контактов, который, например, уменьшается в направлении от проксимальных отделов кишки к дистальным, в связи с чем в том же направлении увеличиваются трансэпителиальная разность потенциалов и электрическое сопротивление (рис. 1.83). Очевидно, что деятельность определенных механизмов, регулирующих рН, обеспечивает локальные трансмембранные градиенты рН и определяет локальные же значения рН в том или ином участке цитоплазмы. В эпителиальных тканях большое значение имеет и трансэпителиальный градиент рН. Указанные градиенты рН влияют на трансмембранный, трансцеллюлярный и трансэпителиальный ток жидкости. Процессы протонирования, депротонирования, гидроксилирования белков внеклеточного матрикса, плазмалеммы и внутриклеточных белков отражают значение для функций секреторной клетки локальных изменений рН и трансмембранных градиентов. Изменяется активность ферментов и аффинность рецепторных доменов в составе внеклеточного матрикса. Нейтральные околоклеточные примембранные значения рН блокируют эндоцитоз и обрекают лиганд—рецепторные комплексы на долгое пребывание на уровне плазмалеммы. При рН < 5 наблюдаются деполяризация мембраны и эндоцитоз, а при рН > 5 гиперполяризация сопровождается сбрасыванием лиганд—рецепторных комплексов с клеточной поверхности.

Рис. 1.83 Структура обкладочной клетки в покое (А) и при стимуляции (Б)

Я — ядро, Р — гладкий плазматический ретикулум, М — митохондрия, К — внутриклеточный каналец, открывающийся в просвет железы, В — вакуоль.

Проницаемость ряда ионных каналов и, соответственно, мембранный потенциал также изменяются рН—зависимо и, с другой стороны, являются механизмом регуляции рН. Так, защелачивание внеклеточного примембранного пространства от 6,7 до 8,3 приводит к увеличению выхода Сl^— из обкладочных клеток слизистой оболочки желудка в 5 раз. Обратный процесс (рН снижается от 7,9 до 6,7) приводит к модификации Са—каналов в Na—каналы. В седалищном нерве лягушки на восходящей фазе ПД, обусловленной лавинообразным входом Na⁺ развивается алкалоз(от позднелат. alkali — щелочь, от араб. al—gali —растительная зола и греч. —osis — суффикс, означающий «процесс», «болезнь»). рН от 6,7 возрастает до 8,3 к пику. Максимально открытые Nа⁺, каналы позволяют протонам входить по градиенту рН. На нисходящей фазе активируется Nа⁺/Н⁺обменник, также вносящий протоны. Поскольку алкалоз—зависимо открываются Cl—каналы в начале фазы следовой гиперполяризации, то вход протонов и анионов способствует компенсаторной нейтрализации вплоть до 6,2.

Активация Na⁺/K⁺—помпы благодаря входу глюкозы и кислорода стимулирует процессы окисления на этой стадии и восстановление энергетического потенциала. В окситоцинергических нейросекреторных клетках гипоталамуса выведение секрета сопряжено с большими энергетическими затратами: на фоне длительного Са—зависимого деполяризационного плато возникают высокочастотные «залповые» ПД, сменяющиеся длительной (до 20 с) следовой гиперполяризацией. Сходная картина электрогенеза характерна и для инсулин—секретирующих (β—клеток поджелудочной железы.

Внутриклеточный алкалоз стимулирует вход йодидов в фолликулярные клетки щитовидной железы с последующим синтезом йод—содержащих гормонов. Ацидоз, усиливая выход ионов кальция из внутриклеточных депо, активирует Са—зависимые процессы: сокращение, хемотаксисы, Са—зависимый экзоцитоз, клеточный цикл, адгезию. Известно, что увеличение внутриклеточного Са²⁺ стимулирует синтез основного Са—связывающего белка кальмодулина (СаМ). При увеличении рН на 0,5 синтез СаМ увеличивается под влиянием Са²⁺ в 5 раз. Поэтому комплексы Са—СаМ и H⁺ рассматриваются как сенсоры внутриклеточного рН и Са²⁺.

Регуляция внутриклеточного рН благодаря процессам трансмембранного транспорта воды, ионов, органических веществ, клеточного дыхания и метаболизма сопряжена с регуляцией осмотического давления и объема клетки, особенно секреторной.

Регуляция объема секреторной клетки. В эпителиальных, особенно поляризованных, клетках изоосмотичность цитоплазмы внеклеточной среды поддерживается благодаря равенству объемов и скоростей воды, поступающей в клетку через апикальную мембрану и покидающей ее через базальную. Нарушение этого равновесия может привести к увеличению или уменьшению объема клетки и изменению ее функций вплоть до гибели. Направление гидравлического градиента и объем свободной воды в клетке определяются концентрацией связывающих молекулы воды осмотически активных ионов (Na⁺, С^—, K⁺, Са²⁺) и органических веществ, т. е. осмотическим градиентом. К органическим осмолитикам относятся: глюкоза, простые липиды и ненасыщеные жирные кислоты, полигидратные алкоголи, лактат, кислые и нейтральные аминокислоты и их нитрогенные растворы, пептиды и другие вещества, образующиеся в процессе транспорта, синтеза и метаболизма.

В роли «сенсоров» изменения объема клетки могут выступать: рост или уменьшение гидратации белков мембраны и цитоплазмы; растяжение или сжатие клеточной мембраны, вызывающее перестройки цитоскелета, активацию или ингибирование ассоциированных с мембраной энзимов (например, аденилатциклазы), транспортеров, рецепторов и ионных каналов; изменение градиентов ионов (ионной силы), осмотического давления и рН (осмохимическая сила); де— или гиперполяризация клеточной мембраны (рис. 1.84).

При возникновении трансмембранного осмотического градиента, приводящего к изменениям объема клетки, запускаются механизмы регуляции, направленные на достижение изоосмотичности вне— и внутриклеточных сред, что приводит к нормализации объема. Этой задаче служит перенос воды гидрофильными ионами (наиболее быстрый механизм регуляции I типа), а также компенсаторные (замедленные) изменения концентраций органических осмолитиков через их трансмембранный транспорт, метаболизм, эндо— или экзоцитоз (П типа). При этом механизмы регуляции объема клетки должны избегать «побочных» энергозатрат на электрогенез и рН—стабилизацию.

Оба типа регуляции используются при регулируемом уменьшении объема клетки (РУМО), раздувшейся в условиях гипоосмолярной среды из—за входа воды, и регулируемом увеличении (РУВО) объема клетки, сжавшейся в гиперосмолярной среде из—за потери воды. Рассмотрим особенности каждого из них.

Регулируемое увеличение объема клетки. По мере уменьшения размеров и гидратированности клетки срабатывают механизмы РУВО I, главным компонентом действия которых является вход Na⁺, CL^— и K⁺. Трансмембранный перенос в клетку осмолитиков — предшественников секрета, эндоцитоз и

Рис. 1.84 Системы регулируемого уменьшения (РУМО I, РУМО II) и увеличения (РУВО I, II) объемов секреторной клетки

протеолиз содержимого эндосом способствуют увеличению внутриклеточного осмотического давления, удерживанию воды в клетке и восстановлению нормального объема.

При гиперосмолярности среды уменьшению объема клеток почечного эпителия позвоночных противодействует накопление сорбитола, глицерофосфата, бетаина, инозитола, таурина, глицина и глутамина. В церебральных нейронах млекопитающих объем и внутриклеточное осмотическое давление регулируются быстрым входом неорганических ионов и низкомолекулярных органических осмолитиков: холина, метиламинов, креатина, инозитола, таурина, нейтральных и анионных аминокислот, ГАМК. Сходные механизмы описаны и в эпителии жабер двустворчатых моллюсков.

Регулируемое уменьшение объема клетки. Механизмы РУМО I используются в эпителиальных клетках, подключая все более сложные варианты по мере увеличения объема. Различают Са—независимые системы РУВО I и Са—зависимые. Первые описаны для эпителия почечных канальцев и включаются через активацию переносчика K⁺/Cl^—, который при нормальном объеме фосфорилирован и неактивен. Увеличение объема подавляет активность протеинкиназ и активирует дефосфорилазы с последующим дефосфорилированием и стимуляцией переносчика. Это стимулирует выход ионов, а вместе с ними воды. Увеличение концентрации Glu, Asp, синтеза фосфолипидов и гликогена (РУМО II) приводит к уменьшению осмотического градиента и нормализации объема клетки.

Са—зависимые системы РУМО I включают механочувствительные Са²⁺— и Са—чувствительные К⁺ и Сl^——каналы: натяжение плазмалеммы при увеличении клеточного объема активирует первые. Через них в клетку поступает Са²⁺, который акцептируется белками Са—чувствительных каналов. Выходящие ионы К⁺ и Сl^— выводят с собой воду, что нормализует объем.

Хлорный канал относится к типу максиСl^——канала, время открытого состояния которого максимально по сравнению с другими типами хлорных каналов. Через него из клетки может выходить вода, продукты анаэробного гликолиза и НСОз^—. Последовательность включения ионных токов обусловливает смену значений потенциала мембраны: первичная С²⁺—зависимая деполяризация сменяется K⁺ и Сl^——зависимой гиперполяризацией. Показано, что при деполяризации в начале РУМО I макси С1^——каналы инактивированы, а позже ненасыщенные жирные кислоты (факторы гиперполяризации) активируют их. В зависимости от степени увеличения объема клетки для их коррекции используются разные механизмы.

С локальной деполяризацией сопряжен эндоцитоз, а с гиперполяризацией — выведение экзоцитозом или транспортерами алифатических аминокислот, холина, миоинозитола, метиламинов, что снижает внутриклеточное осмотическое давление и поступление воды. Этот механизм РУМО II описан для нейронов головного мозга.