1.1.2. Мембранные потенциалы нервных элементов

Для исследования электрических явлений в нервных (и других) клетках широко применяют микроэлектроды (стеклянные пипетки с очень тонким, примерно 0,5 мкм, кончиком), заполненные электролитом. В таком микроэлектроде электролит играет роль проводника тока, а стекло — изолятора. Если кончик микроэлектрода вводят внутрь клетки, то он регистрирует внутриклеточный потенциал (относительно наружного «индифферентного» электрода). В крупные нервные клетки (волокна) удается вводить и проволочные электроды. С помощью внутриклеточных

Рис. 1.5 Регистрация мембранного потенциала покоя

А — микроэлектрод / еще не введен в нервное волокно; луч осциллографа показывает, что разность потенциалов у микроэлектрода и индифферентного электрода 2 равна нулю; Б — микроэлектрод введен в нервное волокно (прокол мембраны); он регистрирует постоянный отрицательный потенциал относительно внешнего раствора — мембранный потенциал покоя (МПП).

Мембранный потенциал покоя. У нейронов, как и у всех исследованных клеток животных и растений, поверхностная мембрана в покое электрически поляризована, т. е. имеет разный электрический потенциал наружной и внутренней поверхностей. В этом можно убедиться, если ввести внутрь клетки микроэлектрод, соединенный с регистрирующей установкой. Как только микроэлектрод попадает внутрь клетки, он мгновенно приобретает некоторый постоянный электроотрицательный потенциал по отношению к электроду, расположенному в окружающей клетку жидкости.

Величина внутриклеточного электрического потенциала у нервных клеток и волокон, например, гигантских нервных волокон кальмара, в покое составляет около —70 мВ.

Эту величину называют мембранным потенциалом покоя (МПП). Во всех точках аксоплазмы этот потенциал практически одинаков.

При выведении кончика микроэлектрода из клетки возвратным движением или прокалыванием ее насквозь разность потенциалов между электродами скачкообразно исчезает (рис. 1.5).

Связь МПП с поляризацией мембраны клетки доказывает, например, опыт по удалению аксоплазмы из гигантского аксона кальмара. Лишенный аксоплазмы аксон при его перфузии солевым раствором (сходным по ионному составу с аксоплазмой) обнаруживает примерно такой же МПП, как и нормальный аксон.

Природа поляризации клеточной мембраны сегодня в основном определена. Чтобы ее понять, необходимо рассмотреть некоторые свойства самой мембраны, а также ионный состав внеклеточной среды и внутриклеточной жидкости. Мембрана, например, у аксона кальмара, как и у всех других клеток, — очень тонкая, но достаточно прочная оболочка. Согласно электронно—микроскопическим данным ее толщина составляет 5—10 нм. В основу современных представлений о структуре мембран положена жидкостно—мозаичная модель (рис. 1.6). Согласно этой модели в жидком липидном бислое плавают глобулярные белки — интегральные и периферические. Одни из них являются ионными каналами, другие (например, гликопротеиды) содержат олигосахаридные белковые цепи, участвующие в узнавании клетками друг друга и межклеточной коммуникации. Структура мембраны высокодинамична: липиды способны к латеральной и вращательной диффузии, они могут переходить из одного монослоя в другой. Белкам свойственна и вращательная диффузия. Однако часть белков иммобилизована («заякорена») структурами цитоскелета и не может свободно плавать. Стало быть, жидкостно—мозаичная модель мембраны верна лишь частично.

В последние годы предложена твердокаркасная жидкостно—мозаичная модель. В этой модели мембрана уподобляется белковому каркасу, ячейки которого заполнены липидным бислоем. В формировании непрерывного каркаса

Рис. 1.6 Трехмерная схема жидкостно—мозаичной модели мембраны

1 — гликолипид, 2 — ионный канал, 3 — фосфолипид, 4 — интегральный белок, 5 — олигосахаридная боковая цепь, б — гидрофобный участок α—спирали, 7 — α—спиральная белковая молекула, 8 — холестерин, 9 — наружная поверхность,

10 — липидная сердцевина, 11 — внутренняя поверхность.

участвуют внутримембранные белки, белки цитоскелета, прилегающие к внутренней поверхности мембраны, а с наружной стороны — белки экстраклеточного матрикса: коллаген, фиброкинин. Важным структурным компонентом мембран является вода. Особенности взаимодействия основных молекулярных элементов с водой не только определяют многие структурно—функциональные свойства мембранных систем, но и становятся решающими в процессе их формирования и стабилизации.

В транспорте веществ через мембрану принято выделять два типа — пассивный и активный транспорт. Пассивный транспорт — перенос неэлектролитов и ионов через мембрану по градиенту химического или электрохимического потенциала. Это может быть простая диффузия через липидный бислой либо облегченная диффузия, осуществляемая переносчиками или по каналам в мембране. Процессы облегченной и простой диффузии направлены на выравнивание градиентов и установление равновесия в системе. Активный транспорт — перенос неэлектролитов и ионов против градиента химического или электрохимического потенциала сопряжен с энергетическими затратами. Основное отличие активного транспорта от облегченной диффузии состоит в том, что одна из стадий активного транспорта энергозависима. Когда для переноса вещества используется энергия аденозинтрифосфата (АТФ) или окислительно—восстановительных реакций, транспорт называют первично—активным. Если же в качестве источника энергии используется градиент концентрации ионов, то транспорт называют вторично—активным. Тип транспорта (пассивный или активный) зависит от изменения свободной энергии транспортируемых катионов.

Сейчас известны следующие механизмы прохождения ионов через мембрану: 1 — растворение иона в липидной фазе мембраны, диффузия и последующий переход из мембраны в раствор, 2 — движение по гидрофильным ионным каналам в мембране, 3 — транспорт с участием переносчиков. В качестве переносчиков чаще всего выступает внутриклеточный циклический аденозин—монофосфат — цАМФ, и инозитолтрифосфат — ИФ₃ (рис. 1.7).

В последнем случае возбуждающий или тормозный внешние сигналы активируют мембранные рецепторы — Д. Эти рецепторы регулируют процесс

Рис. 1.7 Цепь реакций с участником внутриклеточного посредника цАМФ

Rs — возбуждающий рецептор, Ri — тормозный рецептор, Gs — возбуждающий G—белок, G1 — тормозный G—белок, ГТФ — гуанозин—трифосфат, АТФ — аденозитрифосфат, ГДФ — гуанозиндифосфат, АУ — аденилатциклаза, АМФ — аденозинмонофосфат, цАМФ — циклический аденозинмонофосфат, Фн — фосфат. На схеме показаны также фармакологические препараты и токсины, которые запускают (+) или ингибируют (—) некоторые реакции.

связывания G—белков с внутриклеточным ГТФ (гуанозинтрифосфатом), стимулируя или подавляя тем самым внутриклеточную аденилатциклазу (АЦ). Усиливающий фермент АЦ превращает АТФ в цАМФ, который затем при участии фосфодиэстеразы расщепляется до АМФ. Свободный цАМФ диффундирует в клетку и активирует аденилаткиназу (А—киназу), высвобождая ее каталитическую субъединицу С, которая катализирует фосфорилирование внутриклеточных белков, т. е. формирует конечный эффект внутриклеточного стимула. Механизмы эти в равной мере характерны для естественных биологических и для искусственных липидных мембран.

Мембрана состоит из липидов, белков и мукополисахаридов. Бимолекулярный слой липидов является матриксом мембраны. Белки, вкрапленные в липидный матрикс, образуют каналы для воды и ионов, формируют ионные насосы и т. п. (рис. 1.8). Мукополисахариды, располагаясь в виде «деревьев» на поверхности мембраны, осуществляют рецепторные функции. Мембрана постоянно обновляется. При этом ее качества могут несколько меняться в зависимости от изменения программы соответствующих процессов синтеза.

Клеточная мембрана обладает значительными электрическим сопротивлением и емкостью. У аксона кальмара, например, удельное сопротивление мембраны (Rм) (здесь при расчете удельного сопротивления (Rм) значение в омах умножают (а не делят) на площадь мембраны, так как для пересекающего мембрану тока с ростом этой площади сопротивление уменьшается (а не растет)) составляет в покое 1000 Ом х см², а емкость (См) равна примерно 1 мкф/см². Емкость мембраны, которая создается в основном ее липидным матриксом, довольно постоянна. Сопротивление мембраны проходящему току сильно зависит от состояния ее ионных каналов.

Мембрана легко проницаема для жирорастворимых веществ, молекулы которых проникают через липидный матрикс. Крупные водорастворимые молекулы, в том числе анионы органических кислот, по существу, совсем не проходят через мембрану (могут покидать клетку лишь путем экзоцитоза). В то же время в мембране нервного волокна существуют каналы, проницаемые для воды, для малых молекул водорастворимых веществ и для малых ионов.

Рис. 1.8 Строение плазматической мембраны и ее механизмы, ответственные за мембранные потенциалы покоя и действия (упрощенная схема).

А — участок мембраны (продольный срез); Б — условное изображение активного переноса ионов насосом за счет энергии АТФ; В — эквивалентная электрическая схема мембраны: I — насос, 2 — липидный матрикс; заштрихованы белковые макромолекулы, формирующие безворотный ионный какал, специальные натриевые и калиевые каналы с воротными механизмами и насос; горизонтальными стрелками показаны открытие (и закрытие) воротных устройств; вертикальными — направление движения ионов. Rм— сопротивление мембраны, ЕNа — заряд, обусловленный ионами Na, Ек — заряд, обусловленный ионами К, Енас — емкость насоса. См — емкость мембраны.

Рис. 1.9 Основные состояния натриевых каналов

А — в покое; В — при деполяризации; В — при продолжительной деполяризации.

Ионные каналы. Эти мембранные структуры являются интегральными белками (гликопротеинами), пронизывающими липидный бислой и способными при адекватных внешних воздействиях (изменение потенциала на мембране, действие гормона или медиатора) избирательно менять проницаемость мембраны для определенных ионов (Na⁺ K⁺, Са²⁺, Сl^—). Например, в покое (мембрана не деполяризована) натриевый канал не пропускает ионы Na+, поскольку закрыты м—ворота (рис. 1.9). При деполяризации м—ворота открываются и канал активируется, т. е. начинает пропускать ионы Na⁺. Из—за этого м—ворота называют также активационными. В открытом состоянии проводимость канала в значительной степени определяется его селективным фильтром, который не пропускает анионы и гораздо более свободно пропускает Na⁺, чем K⁺ или Са²⁺. При более длительной деполяризации закрываются h—ворота (инактивационные), расположенные у внутренней стороны мембраны, и канал инактивируется. Реполяризация до уровня потенциала покоя вновь приводит к открытию h—ворот и закрытию м—ворот. В этом состоянии канал можно вновь активировать дёполяризующим стимулом.

В основе многих физиологических процессов (передача электрических и химических сигналов, мышечное сокращение, секреторный процесс и т. д.) лежит прежде всего работа ионных каналов. Их характеристики могут изменять некоторые фармакологические препараты и яды.

Каналам биомембран свойственна характерная избирательность для ионов (селективность), а также способность открываться и закрываться при различных воздействиях на мембрану (воротная функция). Переходы каналов из открытого состояния в закрытое (воротный механизм) могут быть обусловлены изменениями мембранного потенциала, взаимодействием с определенными химическими веществами, специфическим фосфорилированием каналов. Воротный механизм каналов управляется сенсором внешнего стимула. В зависимости от локализации сенсора каналы разделяются на две группы.

К первой группе относятся каналы, имеющие собственный сенсор (входящий в состав макромолекулы) внешнего сигнала (рис. 1.10). Внешний стимул влияет непосредственно на макромолекулу канала. Эта группа включает два больших семейства ионных каналов: потенциал— и лигандозависимые.

Потенциалозависимые каналы (Na⁺, K⁺, Са²⁺, Сl^——каналы) открываются и закрываются при изменении электрического потенциала на мембране (рис. 1.11).

Рис. 1.10 Различные способы, управления ионными каналами

А — ионный канал, имеющий собственный сенсор внешних сигналов; Б — ионный канал, имеющий внешний сенсор и опосредованно управляемый химическим сигналом. 1 — первичный посредник (сигнал), 2 — рецептор первичного посредника, 3 — ворота, 4 — внутриклеточный вторичный посредник, 5 — рецептор вторичного посредника; а — наружный раствор, б — цитоплазма.

Рис. 1.11 Строение потенциалозависимого ионного канала

1 — липидный бислой, 2 — сенсор напряжения, 3— ворота, 4 — белковая макромолекула, 5 — якорный белок, 6—углеводные цепи, 7 — селективный фильтр, 8 — водная пора, Р — участок фосфорилирования канала, А — наружный раствор, Б — цитоплазма. Размеры указаны в нанометрах.

Лигандозависимые ионные каналы обеспечивают быструю передачу сигналов между клетками, например, в химических синапсах. Эти каналы открываются при связывании с рецептором ряда биологически активных веществ, таких как ацетилхолин, глутамат, γ—аминомасляная кислота.

В каналах второй группы сенсор внешнего сигнала (рецептор первичного посредника) пространственно разобщен с каналом. Взаимодействие сенсора и канала осуществляется с помощью растворимых внутриклеточных вторичных посредников. Это рецепторзависимые ионные каналы, каналы, опосредованно управляемые химическими сигналами. К ним относятся также каналы, управляемые G—белками, которые активируются при связывании лиганда с рецептором.

В покое практически все натриевые каналы мембраны аксона закрыты, а большое число калиевых — открыто. Определенное состояние ионных каналов мембраны (например, закрытое у натриевых, открытое у значительной части калиевых) очень важно для генерации МПП нервной клеткой. Кроме того, в мембране находятся неспецифические каналы для ионной утечки, каждый из которых проницаем для K⁺, Nа⁺ и Сl^— (больше всего для К⁺). Эти каналы не имеют воротных механизмов, всегда открыты и почти не меняют своего состояния при электрических воздействиях на мембрану.

Ионный насос. Важным условием для формирования МПП является отличие ионного состава аксоплазмы от ионного состава внешней среды.

В табл. 1.1 сопоставлен ионный состав аксоплазмы гигантского аксона и крови кальмара. Различия в этих составах постоянны и в основном сводятся к тому, что в аксоплазме по сравнению с кровью меньше ионов Na⁺, больше К⁺ и несравненно больше органических анионов. Последние не могут проникнуть через неповрежденную мембрану наружу. Что касается катионных различий, то они являются результатом работы так называемого натрий—калиевого насоса мембраны, непрерывно откачивающего Na⁺ из клетки в обмен на К⁺ (см. рис. 1.12).

Та бл и ц а 1.1

Ионный состав аксоплазмы и внешней среды гигантского аксона кальмара, ммоль/кг воды

Вещества	Аксоплазма	Кровь	Морская вода
К^+	400	20	10
Na^+	50	440	460
Сl^—	40—150	560	540
Са^2+	0—4	10	10
Mg^2+	10	54	53
Изотионовая кислота	250	—	—
Аспарагиновая кислота	75	—	—
Глутаминовая кислота	12	—	—
Янтарная и фумаровая кислоты	17	—	—
АТФ	0,7—1,7
Аргининфосфат	1,3—5,7
H2O	865	870	966

Поскольку этот насос работает таким образом, что удаляя из клетки три иона Na⁺, он вводит в нее два иона К⁺, т. е. в конечном счете удаляя из клетки положительные заряды, он может вносить прямой вклад в создание потенциала покоя. Косвенная роль натрий—калиевого насоса связана с тем, что он поддерживает высокую концентрацию калия во внутриклеточной среде. Основным же фактором, ответственным за создание потенциала покоя, служит высокая проницаемость мембраны для калия (по сравнению с другими ионами), благодаря которой калий диффундирует из клетки до тех пор, пока его выходу не будет препятствовать накопление в клетке отрицательных зарядов.

Перенос ионов против градиентов их концентраций называют активным ионным транспортом в отличие от пассивного транспорта — утечки ионов.

Натрий—калиевый насос работает, потребляя энергию АТФ, его основным компонентом является фермент — мембранная Na, К—АТФаза. АТФаза погружена в липидный бислой плазматической мембраны (рис. 1.13). В ходе работы одна молекула АТФ расщепляется на АДФ и фосфат. В норме АТФ поступает к насосу из аксональных митохондрий. Поэтому в лишенном аксоплазмы перфузируемом аксоне насос работает только при добавлении к перфузату АТФ. Для работы насоса, кроме того, требуется наличие в среде ионов K⁺, а внутри волокна — ионов Na⁺. Макромолекулярный механизм насоса работает лишь в случае присоединения к этой системе снаружи ионов К⁺, а изнутри клетки — ионов Na⁺ (рис. 1.8, 1.12, 1.13).

Утечка ионов. Поляризация мембраны при открытых калиевых каналах, т. е. при высокой калиевой проницаемости (Р_k) мембраны и при наличии большого трансмембранного градиента концентраций K⁺ ([К⁺вн) >> [К⁺нар), объясняется прежде всего хотя и очень небольшой, но существующей утечкой внутриклеточного К⁺ в среду.

Утечка К⁺ создает разность электрических потенциалов между средой и аксоплазмой в условиях, когда вход Na⁺ в клетку или выход из нее органических анионов (что могло бы компенсировать нарушения электронейтральности

Рис. 1.12 Прямое и косвенное участие натриевого насоса в создании потенциала покоя

Рис. 1.13 Участие АТФазы в работе натрий—калиевого насоса (объяснение в тексте)

от потери К⁺) исключены свойствами покоящейся мембраны. В этой ситуации на мембране создается двойной электрический слой (снаружи — катионы, главным образом Na⁺, внутри — анионы, главным образом органических кислот), препятствующий дальнейшему выходу К⁺.

Рассмотрим некоторые подробности. Перемещение К⁺ из клетки наружу осуществляется концентрационным градиентом этого иона, совершающим «осмотическую» работу (а_осм):

А_осм= RTln(K+)_нар/(К+)_вн

где R — универсальная газовая постоянная, т. е. кинетическая энергия 1 моля ионов при температуре Т = 1К.

В силу возникающего мембранного потенциала ионы К⁺ частично возвращаются в клетку, при этом совершается электрическая работа Аэл = QE = nFE, где Q — количество электричества, п — валентность, F — число Фарадея (заряд 1 моля одновалентных ионов), Е — потенциал. Если выход ионов К⁺ из клетки преобладает над их возвращением, то постепенно растет Аэл и несколько падает Аосм. В итоге на мембране достигается Е, при котором Аэл ⁼ Аосм для иона К⁺ т. е. калиевый равновесный потенциал, обозначаемый Е_к. Из сказанного следует, что

Е_к=RT/F х ln(К+)_нар/(К+)_вн

или упрощенно (при t = 20 °С)

Ек = 58lg(К+)_нар/(К+)_вн (формула Нернста).

Разность между текущим значением мембранного потенциала, (МП) (МП обозначает любое значение потенциала мембраны, наблюдаемое в состоянии покоя (МПП) и в состоянии возбуждения) и Е_к называют электрохимическим градиентом для К⁺. Электрохимический градиент — причина пассивного движения К⁺ через мембрану в естественных условиях.

Справедливость этих представлений доказывается обратной зависимостью МП нервного волокна от ln (К⁺)_нар (рис. 1.14). По тому же принципу может быть рассчитан электрохимический градиент для Na⁺ (E_Na), Cl^— (E_Cl) или Ca²⁺ (E_Ca).

Мембранный потенциал покоя гигантского аксона кальмара (—70 мВ) близок к его Е_k (—75 мВ), но не точно равен ему, так как МПП здесь формируется не только утечкой ионов K⁺, но и утечкой ионов Na⁺ и Сl^—. При этом поступление Сl^— в аксон (E_Cl = —70 мВ) повышает (повышением МПП условно называют увеличение электроотрицательности внутренней поверхности мембраны), а Na⁺ — понижает МПП (Е_Na= +55 мВ).

Итоговая величина Е, создаваемого утечкой ионов К⁺, Na⁺ и Сl^—, может быть достаточно точно рассчитана по формуле Гольдмана

E = RT/F х ln P_K(K⁺)_НАР + P_Na(Na⁺)_НАР + P_Cl(Cl^—)_ВН / P_K(K⁺)_ВН + P_Na(Na⁺)_ВН + P_Cl(Cl^—)_НАР

где Р — проницаемость мембраны для соответствующих ионов. Ее часто выражают в относительных величинах, принимая Р_k за единицу. Для мембраны аксона кальмара в покое отношение Р_к; P_Na:p_ci ⁼ 1 : 0,04 : 0,45.

Утечка ионов, прежде всего ионов К⁺, формирует так называемый концентрационный потенциал (Еконц )— основную часть реального МПП.

Прямой электрогенный эффект насоса. В перфузируемом чистым солевым раствором гигантском аксоне кальмара утечка ионов — это, по существу, единственный механизм формирования МПП, но в естественных условиях в образовании МПП участвует еще один добавочный механизм — прямой электрогенньй эффект натрий—калиевого насоса (рис. 1.15).

Рис. 1.14 Зависимость мембранного потенциала (МП) нервного волокна каракатицы от наружной концентрации К+(1) и величина МП, рассчитанная по уравнению Нернста для калиевого электрода (2)

Прямой электрогенный эффект насоса (который следует отличать от неэлектрогенного, т. е. от участия насоса в создании концентрационных градиентов) состоит в поляризации мембраны, возникающей при неравенстве числа (q) ионов Na⁺ и К⁺, которые переносятся в каждом цикле работы насоса.

Только если эти числа равны, насос работает электронейтрально. Если q_Nа > q_K, то его работа увеличивает Е_м (так происходит в нервных и мышечных клетках), если же q_Nа << q_K то Е_м уменьшается, что, по—видимому, происходит в шванновских клетках. В нервных волокнах и клетках q_Nа / q_K ⁼ 3/2.

Прямой электрогенный эффект насоса (Е_нас) зависит не только от скорости переноса заряда насосом, но и от скорости утечки последних в противоположном направлении. В условиях стационарности электрический ток насоса (I_нас) равен току утечки (I_у), создаваемому за счет Е_нас. Кроме того, ток утечки зависит от электрического сопротивления мембраны. Таким образом, I_y = E_нас/R_м, откуда I_нас ⁼ E_нас/R_м и, соответственно, Е_нас = I_нacR_м. У гигантского аксона кальмара

Рис. 1.15 Две гипотезы, о механизме работы натрий—калиевого насоса мембраны.

А — схема с перемещающимися внутримембранными частицами; Б — схема с мембранной макромолекулой, ритмически изменяющей свою конформацию: / — внутриклеточная среда, II — мембрана, III — внеклеточная среда; 1 — транспортируемое вещество, 2 — транспортирующие частицы, 3 — макромолекула, ритмически меняющая свою конформацию (за счет энергии АТФ): а — конформация для отдачи вещества во внешнюю среду, б — конформация для приема вещества из клетки; стрелками показано направление движения частиц.

r_m относительно мало, и поэтому E_нас тоже невелико (~1 мВ). В некоторых нервных клетках моллюсков, где R_м велико (мегаомы), Е_нас достигает десятка милливольт.

Электрогенный эффект насоса может быть быстро устранен или блокадой мембранной Na, К—АТФазы с помощью сердечных гликозидов (оубаина и др.), или снижением температуры до 5 ^оС, или нарушением выработки АТФ (при действии динитрофенола и цианидов, гипоксии). Концентрационный потенциал при этом не исчезает, а снижается достаточно медленно по мере потери ионных градиентов на мембране. Реальный МПП складывается из Е_конц и Е_нас.

В миелинизированных нервных волокнах у позвоночных МПП перехвата Ранвье составляет около —70 мВ. Его концентрационный компонент имеет в основном калиевую природу, как и в аксоне кальмара. Электрогенный эффект ионного насоса в нормальной среде здесь близок к нулю и только при повышенной концентрации K⁺ снаружи этот эффект усиливается настолько, что может достигнуть 3—4 мВ. Последнее происходит за счет усиления насосного тока.

Функция мембранного потенциала покоя. В самой мембране МПП проявляется как электрическое поле значительной напряженности (10⁵ В/см). Это поле воздействует на макромолекулы мембраны и придает их заряженным группам определенную пространственную ориентацию.

Особенно важно то, что электрическое поле МПП обеспечивает закрытое состояние так называемых активационных ворот натриевых каналов и открытое состояние их инактивационных ворот (см. разд. 1.1.3). Этим обеспечивается состояние покоя и готовности к возбуждению.

Даже относительно небольшой сброс мембранного потенциала (частичная деполяризация) открывает активационные ворота этих каналов и выводит клетку из состояния покоя, дает начало возбуждению. При возбуждении используется электрическая энергия, накопленная в МПП.