Лекарственные воздействия через рецепторы

врожденного иммунитета

И.Г. Козлов

Кафедра фармакологии и Отдел иммунологии, РГМУ.

В 1893 году американский хирург Вильям Колей (William Coley) впервые использовал в медицинской практике неочищенный экстракт лизированных бактерий, получивший впоследствии название «токсина Колейа». С помощью данного препарата Колей провел курс терапии 894 пациентам с подтвержденным диагнозом карцинома или саркома и добился 45% увеличения пятилетней выживаемости больных по сравнению с традиционными для того времени способами лечения.

Учитывая достигнутый Вильямом Колейем успех, неудивительно, что в течение следующего столетия предпринимались многочисленные исследования, направленные на разработку новых бактериальных экстрактов или лизатов, расширение спектра их клинического применения, изучение механизмов действия, как самих комплексных препаратов, так и отдельных компонентов, входящих в их состав.

В результате этих исследований к настоящему времени появилось несколько десятков препаратов данного типа, которые нашли широкое применение в различных областях современной медицины. Уже в самом начале изучения влияния бактериальных экстрактов и лизатов на организм пациентов было обнаружено, что их клинический эффект реализуется через воздействие на иммунную систему. В связи с этим они были отнесены к группе иммунотропных препаратов и в современной классификации их выделили в отдельную подгруппу: «Иммуномодуляторы микробного происхождения» (ИМП).

Таблица 1.

Классификация иммуномодуляторов микробного происхождения

· Лизаты микроорганизмов

# Полипатогенные (бронхомунал, иммудон, ИРС-19, паспат)

# Монопатогенные (постеризан)

· Частично очищенные компоненты

# Липополисахариды (продигиозан, пирогенал, лентинан)

# Пептидогликаны (рибомунил, иммуномакс)

# Рибосомы (рибомунил)

# Нуклеиновые кислоты (нуклеинат натрия, ридостин)

· Минимальные биологически активные фрагменты

# Глюкозаминмурамилдипептид - ГМДП (ликопид)
# CpG олигонуклеотиды (промун, актилон, ваксиммун)

Несмотря на очевидный прогресс в разработке все новых ИМП и накоплении успешного опыта использования их в клинике, до последнего времени оставалось много вопросов о конкретных молекулярных и клеточных механизмах действия этих препаратов. Среди наиболее точно установленных фактов следует выделить следующие:

· ИМП влияют на иммунную систему иначе, чем вакцины. Как известно, основной целью вакцинации является активация адоптивного иммунного ответа с образованием антиген-специфических в отношении определенного патогена клонов Т- и В-лимфоцитов, а также Т-клеток памяти. В случае ИМП доказательств развития устойчивого антиген-специфического Т- и В-клеточного иммунного ответа в отношении компонентов препарата получить не удалось.

· Факты об усилении под влиянием ИМП активности Т-эффекторов (противоопухолевый и противовирусный иммунный ответ) и В-клеток (возрастание продукции IgА) по временным и количественным параметрам скорее свидетельствуют об активации уже имеющихся зрелых антиген-специфических лимфоцитов, чем о формировании новых клонов, специализированных в отношении входящих в состав ИМП компонентов.

· Эмпирически подобранный в клинике режим дозирования ИМП (как правило длительное введение в течении нескольких дней/недель) не соответствует схемам вакцинации и оптимальным условиям формирования адоптивного иммунного ответа.

· Основной мишенью для ИМП в иммунной системе являются клетки врожденной иммунной системы: мононуклеарные фагоциты, естественные киллеры, В-лимфоциты, полиморфноядерные лейкоциты, эпителиальные и дендритные клетки. Под действием ИМП происходит быстрая активация этих клеток, которая наиболее часто проявляется в виде двух феноменов: возрастании их эффекторного потенциала и продукции цитокинов.

Переломным моментом в ответе на вопрос о механизмах действия ИМП можно считать стремительное нарастание результатов широкомасштабных исследований, посвященных ключевым молекулярным механизмам функционирования системы врожденного иммунитета. Значительное количество накопленного к настоящему времени фактического материала по данной тематике, к сожалению, не позволяет в рамках данного обзора подробно рассмотреть все тонкости «работы» системы врожденного иммунитета. В связи с этим мы остановимся только на нескольких основных рецепторах, связывающих воедино все компоненты системы и координирующих ее деятельность.

Итак, в отличие от адаптивной иммунной системы, тонко настраиваемой на каждый проникший в организм антиген, система врожденного иммунитета сфокусирована на нескольких высоко консервативных структурах, общих для многих видов микроорганизмов. Эти структуры получили название «патоген-ассоциированные молекулярные образы» или PAMP (patogen-associated molecular patterns), а соответствующие им рецепторы врожденной иммунной системы – «образраспознающих рецепторов» или PRR (pattern-recognition receptors).

Наиболее известными PAMP являются бактериальный липополисахарид (грам-отрицательные бактерии), липотейхоевые кислоты (грам-положительные бактерии), пептидогликан (грам-отрицательные и грам-положительные бактерии) маннаны, бактериальная ДНК, двуспиральные РНК (вирусы) и глюканы (грибы).

Несмотря на значительные химические различия этих веществ, все РАМР имеют общие свойства:

· РАМР синтезируются только микроорганизмами; их синтез невозможен в клетках макроорганизма. В связи с этим, распознавание РАМР каким-либо из PRR является сигналом о наличие в организме хозяина инфекции.

· РАМР являются наиболее общими в мире микроорганизмов структурами, характерными для больших групп (целых классов) патогенов. Например, ЛПС входит в состав клеточной стенки всех грам-отрицательных бактерий и его распознавание сигнализирует о любой грамотрицательной инфекции.

· Структуры в составе РАМР, распознаваемые PRR (а значит и врожденной иммунной системой), являются важными для выживания и патогенности микроорганизмов. В соответствии с этим, РАМР имеют наиболее низкую скорость структурных изменений в процессе эволюции микроорганизмов. Если же изменения в РАМР все-таки происходят, то наиболее часто это сопровождается утратой агрессии патогена по отношению к организму хозяина.

Рецепторы, распознающие РАМР, по структурным характеристикам относятся к нескольким классам белковых молекул. По функции PRR можно разделить на две группы: эндоцитозные и сигнальные (табл. 2).

Таблица 2. Классификация и специфичность рецепторов врожденной иммунной системы

Тип PRR	PRR	Лиганды	Тип патогена
Эндоцитозные	Маннозные	Углеводы и гликопротеиды с высоким содержанием маннозы (маннаны)	· грам-[+], · грам-[-], · грибы
	Скавенджер	ЛПС, пептидогликаны, липотейхоевые кислоты	· грам-[+], · грам-[-],
Сигнальные	TLR-1	Триациллипопептиды, модулин M. tuberculosis	· грам-[+], · грам-[-],
	TLR-2	Липопротеиды большинства патогенов, пептидогликаны, липотейхоевые и маннуроновые кислоты, порины Neisseria, атипичные ЛПС, факторы вирулентности Yersinia, вирионы CMV, зимозан	· грам-[+], · грам-[-], · грибы · вирусы
	TLR-3	Двунитчатая РНК	· вирусы
	TLR-4	ЛПС грам-отрицательных бактерий, HSP60, полимерные маннуроновые кислоты, флаволипиды, тейхуроновые кислоты, пневмолизин, оболочечный белок RSV	· грам-[+], · грам-[-], · вирусы
	TLR-5	Флагеллин	· грам-[+]
	TLR-6	Диациллипопептиды, модулин, липотейхоевая кислота, зимозан	· грам-[+], · грибы
	TLR-7	Однонитчатая РНК, синтетические вещества	· вирусы
	TLR-8	Однонитчатая РНК, синтетические вещества	· вирусы
	TLR-9	Неметилированная СpG ДНК	· грам-[+], · грам-[-]
	TLR-10	Неизвестны
	TLR-11	Уропатогенные бактерии
	NOD1	Пептидогликаны (GM-TriDap)	· грам-[+]
	NOD2	Пептидогликаны (ГМДП)	· грам-[+]

Эндоцитозные PRR (маннозные рецепторы и рецепторы-мусорщики) экспрессированы на поверхности профессиональных антиген-представляющих клеток (фагоцитов). После распознавания соответствующего РАМР они опосредуют поглощение и доставку к лизосомам патогена, где впоследствии происходит его разрушение с образованием антигенных детерминант, которые в комплексе с молекулами ГКГС класса II представляются клеткам адаптивной иммунной системы и запускают классический иммунный ответ. Очевидно, именно через эндоцитозные PRR преимущественно реализуется ответ на антигены вакцин (Рис. 1).

Рис. 1. Реализация иммунного ответа через эндоцитозные и сигнальные PRR

Среди сигнальных рецепторов центральное место занимают так называемые Toll-like (TLR) и NOD рецепторы. У человека семейство TLR в настоящее время насчитывает 11 членов, 10 из которых распознают практически все известные РАМР грамположительных и грам-отрицательных бактерий, вирусов и грибов. Кроме того, среди лигандов TLR могут быть отдельные лекарственные препараты.

Из четырех белков NOD-семейства NOD1 и NOD2 относятся к PRR. В качестве РАМР для этих PRR выступают различные фрагменты пептидогликана – основного компонента клеточной стенки всех грам-негативных бактерий. NOD1 распознает диаминопимелат-содержащий мурамилтрипептид (GM-Tri_Dap), а NOD2 – минимальный биологически активный фрагмент пептидогликана – глюкозаминилмурамилдипептид (ГМДП). В отличие от TLR NOD рецепторы локализованы цитоплазматически. Подобная локализация и специфичность NOD рецепторов свидетельствуют о существовании у клеток, системы «оповещения о несанкционированном прорыве» любого грам-негативного патогена внутрь клетки или «побега» его из фаголизосомы.

В отличие от эндоцитозных конечным результатом взаимодействия сигнальных PRR с РАМР является активация экспрессии большого количества генов и, в частности, генов провоспалительных цитокинов, которая опосредуется через активацию транскрипционного фактора NF-kB. Сигнал с TLR и NOD рецепторов инициирует синтез ИЛ-1, -2, -6, -8, -12, фактора некроза опухолей альфа, интерферона гамма, гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора. Помимо цитокинов мишенями для NF-kB служат гены молекул адгезии, острофазовых белков, ферментов воспаления (NO-синтазы и циклооксигеназы, молекул ГКГС и т.д.

На уровне организма активация синтеза и секреции перечисленных молекул приводит к развитию воспалительной реакции с подключением всех имеющихся систем защиты от патогенов. На клеточном уровне эффект реализуется в трех направлениях. Во-первых, происходит активация самих фагоцитов и значительное усиление их эффекторного потенциала (фагоцитоз, переваривающая активность, продукция активных форм кислорода). Во-вторых, уже имеющиеся антиген-специфические клетки адаптивного иммунитета переходят в активированное состояние и усиливают свои эффекторные функции. В частности, зрелые В-лимфоциты увеличивают продукцию Ig и становятся более чувствительными к антигенной стимуляции, а Т-эффекторы наращивают киллерные функции. И, в-третьих, происходит активация наивных лимфоцитов и подготовка их началу адаптивного иммунного ответа.

Учитывая, что для реализации эффекта с сигнальных PRR не требуется пролиферации клеток и формирования антиген-специфического клона (необходимых при адаптивном иммунном ответе), эффекторные реакции после распознавания данными рецепторами РАМР наступают немедленно. Этот факт объясняет высокую скорость врожденных иммунных реакций.

В заключении этой части обзора следует отметить, что исследования в области молекулярной биологии системы врожденного иммунитета еще далеки от завершения. Остается множество вопросов как по составу РАМР, так и по спектру PRR, системам передачи сигнала, взаимодействию врожденного и адаптивного иммунитета.

Однако уже на основании имеющихся данных можно с уверенностью утверждать, что ИМП – это комплексные РАМР-содержащие препараты, оказывающие влияние на врожденную иммунную систему преимущественно через сигнальные PRR. Это – один из главных положительных с точки зрения практики выводов из проведенных фундаментальных исследований.

Вместе с тем, экстраполяция представленных выше данных о взаимодействии в системе РАМР-PRR на имеющиеся ИМП, позволяет сделать и неутешительный вывод: большинство используемых в практике препаратов не оптимизированы по составу.

Для примера проанализируем два широко известных ИМП (табл. 3). В состав обоих препаратов входит значительное количество компонентов, которые, по мнению разработчиков, должны усилить и оптимизировать их действие. На самом деле, исходя из современной концепции, многие из составляющих данных ИМП распознаются одним и тем же набором TLR и, как следствие вызывают идентичный ответ клетки. Иначе говоря, приведенные в пример препараты страдают явной избыточностью (а как известно из опыта фармакологии каждый лишний компонент повышает стоимость препарата и создает дополнительный риск развития побочных эффектов).

Таблица 3 Экстраполяция РАМР-PRR взаимодействия на имеющиеся ИМП

Препарат	Состав		PRR
	Группа	Представитель
А	Грам-[-]	Acinetobacter calcoaceticus Haemophilus influenzae Klebsiella pneumoniae Moraxella catarrhalis Neisseria subflava	TLR-1 (?), TLR-2, TLR-4, TLR-9
	Грам-[+]	Enterococcus faecium Enterococcus faecalis Staphylococcus aureus Streptococcus dysgalactiae Streptococcus group G Streptococcus pneumoniae (тип I-III, V, VIII, XII) Streptococcus pyogenes	TLR-2, TLR-4, TLR-6 (?), TLR-9, NOD1-2
В	Грам-[-]	Haemophilus influenzae Klebsiella pneumoniae Klebsiella ozaenae Moraxella catarrhalis	TLR-2, TLR-4, TLR-9
	Грам-[+]	Staphylococcus aureus Streptococcus pneumoniae Streptococcus viridans Streptococcus pyogenes	TLR-2, TLR-4, TLR-6 (?), TLR-9, NOD1-2

Примечание: В препарате А находится лизат 18 патогенов, а в препарате В - 8 патогенов. Все они распознаются только 5 PRR (главную роль в распознавании играют TLR-2, -4, и –9).

Более того, исходя из специфичности известных к настоящему времени сигнальных PRR, помимо «работающих» в ряде ИМП можно обнаружить компоненты, которые не соответствуют характеристикам РАМР и для которых до сих пор не идентифицированы рецепторы (например, рибосомы или РНК бактерий).

Все это свидетельствует о том, что, несмотря на долгую успешную практику клинического использования, в области ИМП назрела необходимость изменений. И такие изменения уже идут полным ходом.

Какова же перспектива в развитии ИМП нового поколения? Казалось бы она очевидна. Зная специфичность PRR и используя возможности современной препаративной биохимии, достаточно просто получить высокоочищенные РАМР и заменить ими имеющиеся препараты. По такому пути уже прошли очень многие области фармакологии.

Однако проведенные исследования и имеющийся клинический опыт свидетельствуют о невозможности подобного решения вопроса. Это связано с тем, что многие РАМР являются высокомолекулярными (и даже в ряде случаев надмолекулярными) веществами, имеющими в своем составе помимо последовательностей, распознаваемых PRR, большое количество других активных группировок. На практике это проявляется в виде серьезных побочных эффектов и токсичности. Хорошей иллюстрацией вышесказанному может служить ЛПС. Сегодня уже точно доказано, что ЛПС является важнейшим этиопатогенетическим фактором так называемого «грамотрицательного септического шока» и его введение в организм в высоких дозах приводит к гибели животных. Лекарственный препарат, созданный на основе ЛПС и до недавнего времени использовавшийся в клинике (пирогенал), также характеризуется выраженным пирогенным действием и частыми побочными эффектами преимущественно токсического характера. Аналогичная картина наблюдается у животных при введении смеси двух очищенных грамположительных РАМР: протеингликана и липотейхоевых кислот патогенных штаммов бактерий (грамположительный септический шок). В связи с этим, даже высокоочищенные РАМР также как и лизаты пригодны только для наружного применения.

Идеологическим решением проблемы оптимизации ИМП стало выявление в структуре РАМР минимальных биологически активных фрагментов (МБАФ) и получение на их основе лекарственных препаратов. Вторым возможным решением является подбор химических агонистов PRR. Работы в этой области только начинаются. Несмотря на это, уже имеются несколько успешных разработок (табл. 4), и в частности, ГМДП (NOD2 рецептор), GM-Tri_Dap (NOD2), неметилированные CpG олигонуклеотиды (TLR-9), имиквимод и изатарибин (химические агонисты TLR-7).

Таблица 4. Известные МБАФ и их рецепторы

Тип препарата	PAMP	PRR
МБАФ (пептидогликан)	ГМДП	NOD2
МБАФ (пептидогликан)	GM-TriDap	NOD1
МБАФ (бактериальная ДНК)	CpG	TLR-9
Химический агонист	имиквимод	TLR-7
Химический агонист	изатарибин	TLR-7

МБАФ – минимальные биологически активные фрагменты

Наиболее демонстративным примером, подтверждающим правильность выбранной идеологии, может служить ГМДП. Этот МБАФ не только исследуется уже более 20 лет, но и применяется в клинике на протяжении последнего десятилетия (препарат Ликопид).

По структуре ГМДП представляет собой дипептид (L-аланин-D-изоглютамин), соединенный с двумя сахарными остатками (N-ацетилглюгозамин-N-ацетимурамил). ГМДП является минимальным биологически активным компонентом пептидогликанов, входящих в состав клеточной стенки всех грам-положительных бактерий.

В недавних исследованиях было продемонстрировано, что рецептором для ГМДП является PRR - NOD2. Взаимодействия ГМДП-NOD2 абсолютно специфично – любые изменения в структуре ГМДП приводят к отсутствию связывания с рецептором. Это доказывает, что ГМДП является истинным МБАФ для NOD2 рецептора. Результатом взаимодействия лиганд-рецептор является активация NF-kB, что, в свою очередь, свидетельствует о сохранении у ГМДП биологической активности, характерной для пептидогликана (истинный агонист).

В отличие от препаратов, содержащих пептидогликан, ГМДП пригоден для парентерального и энтерального введения. Тяжелых побочных эффектов даже при очень высоких дозах (в десятки раз превышающих терапевтические) выявлено не было. Пирогенная реакция – умеренная. Интересной деталью фармакокинетики ГМДП является почти полное отсутствие метаболизма препарата в организме. Это, с одной стороны, исключает гепатотоксичность препарата, а, с другой, еще раз подтверждает его принадлежность к МБАФ.

В экспериментальных исследованиях показано, что ГМДП является сильным активатором врожденной и адаптивной иммунной системы. Эти результаты подтверждены многочисленными клиническими испытаниями, проведенными более, чем на 1000 пациентах с различными хроническими инфекционно-воспалительными заболеваниями. Хороший клинический эффект ГМДП у пациентов с бронхиальной астмой (иммуноагрессия по Тh2 типу) и псориазом (иммуноагрессия по Тh1 типу) свидетельствуют о способности препарата восстанавливать нарушенный Т-хелперный баланс.

Завершая данную лекцию, хотелось бы отметить, что иммунология, очевидно, перешла от стадии интенсивных фундаментальных и эмпирических клинических исследований в область планового создания высокоэффективных и безопасных лекарственных препаратов на основе точного знания механизма их действия. За последнее десятилетие значительный прогресс был достигнут сразу в четырех направлениях (гуманизированные моноклональные антител, цитокины и препараты, изменяющие Th1/Th2 баланс), одним из которых является лекарственное воздействие через рецепторы врожденного иммунитета.

<<Предыдущая

Главная

Содержание

Следующая>>