Глава 2

ПЕРЕДАЧА ИНФОРМАЦИИ ПОСРЕДСТВОМ ЭЛЕКТРИЧЕСКОГО ВОЗБУЖДЕНИЯ

Й. Дудель

В организме существуют две системы передачи информации на относительно большие расстояния –гормональная и нервная. О принципах высвобождения, распределения и действия гормонов упоминалось в предыдущей главе, а подробно эти вопросы излагаются в гл. 17. Нервная система характеризуется более высокой скоростью и большей «индивидуальностью» передачи сигналов. В качестве основы для последующих глав, посвященных специфическим функциям нервной системы, мы рассмотрим сначала функциональные свойства одиночных нервных клеток (нейронов), а затем– принципы нейронных взаимодействий (гл. 3). Характерной чертой нервной клетки является то, что она функционирует посредством изменений мембранного потенциала. Поэтому мы начнем с рассмотрения клеточных потенциалов.

2.1. Потенциал покоя

Регистрация. Как и у всех других клеток организма (с. 13), по обе стороны клеточной мембраны нейрона существует разность потенциалов. Установка для регистрации мембранного потенциала показана на рис. 2.1. Датчиком потенциала является микроэлектрод– стеклянный капилляр с оттянутым очень тонким кончиком (диаметром < 1 мкм), который заполнен раствором, проводящим электрический ток. Референтным электродом во внеклеточном пространстве служит хлорированная серебряная пластинка. Исходно оба электрода находятся во внеклеточном пространстве (рис. 2.1,Б, слева), и разность потенциалов между ними отсутствует; на рис. 2.1,5 «внеклеточному потенциалу» соответствует нулевое значение. Если теперь регистрирующий электрод ввести через мембрану в клетку (рис. 2.1,5), то вольтметр показывает скачкообразный сдвиг потенциала примерно до —80 мВ. Этот сдвиг потенциала называется мембранным потенциалом.

Мембранный потенциал нервной и мышечной клеток остается постоянным в течение длительного времени, если только клетка не активируется каким–либо внешним воздействием. Мембранный потенциал такой покоящейся клетки называют потенциалом покоя (рис. 2.1,В). Потенциал покоя нервной и мышечной клеток всегда отрицателен; для каждого типа клеток характерны свои постоянные значения потенциала покоя. У теплокровных животных этот потенциал составляет от —55 до —100 мВ, за исключением гладкомышечных клеток, потенциал покоя которых ниже (—30 мВ).

Диффузионный потенциал. Ранее было отмечено, что потенциал покоя представляет собой диффузионный потенциал ионов, которые пассивно перемещаются через каналы в мембране (гл. 1, уравнение 7,). В состоянии покоя большинство открытых каналов мембраны являются К ⁺–каналами; следовательно, потенциал покоя в первом приближении

Рис. 2.1. А В. Внутриклеточная регистрация мембранного потенциала. А. Клетка помещена в камеру, заполненную плазмой крови (или физиологическим раствором). Б. Слева: когда оба электрода, отводящий и, индифферентный, находятся вне клетки, вольтметр регистрирует между ними нулевую разность потенциалов. Справа: когда отводящий электрод введен в клетку, а индифферентный находится вне клетки, вольтметр регистрирует величину потенциала покоя. В. Потенциал до и после введения электрода в клетку

определяется трансмембранным градиентом концентрации К⁺. На рис. 2.2 показана зависимость измеренного потенциала от внеклеточной концентрации К⁺[К⁺]_out. После сдвига внеклеточной концентрации K+ внутриклеточная концентрация сначала сохраняется на прежнем уровне, и в течение этого короткого промежутка времени измеряемый К⁺–потенциал должен в соответствии с уравнением Нернста изменяться пропорционально логарифму [К⁺]_out. Этот К⁺–потенциал, Е_K, обозначен красной линией на рис. 2.2. Регистрируемые значения потенциала покоя в верхнем диапазоне очень близки к Е_K, однако по мере снижения [К⁺]_out они становятся все менее отрицательными по сравнению с Е_K. Это расхождение следует отнести за счет относительно большего вклада натриевой проницаемости Р_Na при низком значении [К⁺]_out (гл. 1, уравнение 7). Отклонение регистрируемых значений потенциала покоя от Е_K исчезает, если прекратить поступление Na⁺, например, путем замещения внеклеточного Na⁺ таким неспособным к диффузии катионом, как холин. Отсюда следует, что нормальный потенциал покоя примерно на 10 мВ более положителен, чем Е_K.

Изменения внеклеточной концентрации К⁺. В плазме крови концентрация К⁺ обычно поддерживается близкой к своему нормальному уровню–4 мМ (табл. 1.1 ). Однако во многих нервных клетках не происходит быстрого обмена ионов с плазмой, и для них [К⁺]_оut может существенно отличаться от нормального уровня. На рис. 2.3 схематически изображен нейрон ЦНС, который отделен от ближайшего капилляра глиальными клетками. Здесь внеклеточное пространство существует в виде узких щелей шириной примерно 15 нм. Периферические аксоны аналогичным образом тесно окружены шванновскими клетками. Такие интерстициальные пространства вполне адекватно обеспечивают в длительных временных масштабах выравнивание состава внешней среды путем диффузии, однако при интенсивной активности нейронов концентрации ионов во внеклеточном пространстве могут на короткое время значительно изменяться. Во время интенсивной электрической активности ионы Na⁺ входят в клетку, а ионы К⁺ выходят из нее.

Высокая внеклеточная концентрация Na⁺ при этом заметно не меняется, тогда как концентрация К⁺ может существенно– возрастать. Внеклеточную концентрацию K⁺ можно измерить с помощью микроэлектродов, заполненных селективными К⁺ –ионообменниками. При высокой активности нервных клеток внеклеточная концентрация К⁺ возрастает от нормального уровня 3 – 4 мМ до 10 мМ [13]. Согласно уравнению Нернста (см. рис. 2.2), такие высокие внеклеточные концентрации K⁺ вызывают

Рис. 2.2. Зависимость потенциала покоя в мышечном волокне лягушки (ордината) от внеклеточной концентрации К⁺ (абсцисса, логарифмическая шкала). Кружками отмечены значения мембранного потенциала, измеренного при различных концентрациях ионов калия [К⁺]_out. Прямая линия отражает соотношение между калиевым равновесным потенциалом и [К⁺]_out, рассчитанное по уравнению Нернста. Коэффициент 58 учитывает пониженную температуру тела лягушки (по [7] с изменениями)

сильную деполяризацию нервных клеток–Не исключено, что деполяризация, которая обусловлена повышенной внеклеточной концентрацией К⁺ , является одной из причин развития в мозге судорожных разрядов, возникающих, например, во время эпилептических приступов [13]. После окончания интенсивной работы клеток процесс активного транспорта К⁺ может сдвинуть его внеклеточную концентрацию ниже нормального уровня, вызывая гиперполяризацию нервных клеток.

Во время активности нейронов ЦНС может изменяться внеклеточная концентрация еще одного иона–Са²⁺. Концентрацию Са²⁺, так же как и концентрацию K⁺, можно измерить с помощью микроэлектродов, заполненных селективным ионообменником. При активации синаптических окончаний Са²⁺, входит в них (см. рис. 3.15); соответственно во время их высокочастотного возбуждения обнаруживается снижение внеклеточной концентрации Са²⁺. При низкой концентрации Са²⁺, повышается возбудимость нейронов (см. ниже, рис. 2.10), что может приводить к патологическим изменениям в них [13].

Влияние глии на состав межклеточной среды.

Каковы реакции клеток глии на изменения межклеточной концентрации ионов? На рис. 2.3, А представлены результаты регистрации мембранного

Рис. 2.3. А–Г. Свойства глиальных клеток. А. Схема относительного расположения нейронов, глии и капилляров, составленная по электронно–микроскопическим данным. Астроцит (обозначен розовым цветом), в который введен микроэлектрод для регистрации мембранного потенциала, находится между капилляром и нейроном. Все клетки разделены межклеточными промежутками шириной примерно 15 нм (на схеме относительная ширина щелей увеличена). Б. Зависимость мембранного потенциала глиальных клеток (ордината) от внеклеточной концентрации калия [К⁺]_out. Средний уровень потенциала покоя (ПП) составляет —89 мВ. Экспериментальные данные отклоняются от потенциалов, рассчитанных по уравнению Нернста, только при [К⁺]_out.= 0,3 мМ. В. Деполяризация глиальных клеток, обусловленная активностью окружающих нейронов, в зрительном нерве протея (Necturus), при его раздражении одним или тремя стимулами с интервалами 1 с (показаны вертикальными стрелками). Г. Деполяризация глиальных клеток в том же препарате во время серии стимулов длительностью 20 с при частоте 1, 2 или 5 Гц; в последнем случае деполяризация достигает почти 20 мВ. в и Г: следует обратить внимание на гораздо более медленный (секунды!) временной ход деполяризации по сравнению с потенциалом действия (по [6] с изменениями)

потенциала глиальной клетки, а на рис. 2.3, Б изображен график зависимости мембранного потенциала от внеклеточной концентрации К⁺ . Эти данные ближе соответствуют кривой для К⁺–электрода, рассчитанной по уравнению Нернста, чем результаты, полученные на мышечных клетках (рис. 2.2). Таким образом, преобладание К⁺–проницаемости выражено в мембране глиальных клеток еще лучше. В соответствии с этим глиальные клетки деполяризуются, когда активность соседних нейронов приводит к повышению внеклеточной концентрации K⁺ (рис. 2.3, В, Г). Последующее снижение концентрации К⁺ сопровождается ослаблением деполяризации глиальных клеток с постоянной времени порядка нескольких секунд. Такое снижение внеклеточной концентрации К⁺ частично обусловлено глией. Глиальные клетки образуют друг с другом электрические связи посредством щелевых контактов (рис. 3.20), так же как клетки эпителия и гладких мышц. Когда несколько глиальных клеток деполяризуется вследствие местного повышения концентрации К⁺ , между деполяризованными и недеполяризованными клетками возникает ток. Этот электрический ток обусловливает поступление К⁺ в деполяризованные глиальные клетки, уменьшая внеклеточную концентрацию К⁺. Благодаря высокой К⁺–проницаемости и электрическим связям между глиальными клетками они действуют как буфер в случае повышения внеклеточной концентрации К⁺. Данные об активном поглощении К⁺ глиальными клетками с помощью ионного насоса отсутствуют, хотя, возможно, глиальные клетки активно поглощают медиаторы в некоторых синапсах, ограничивая таким образом время действия этих медиаторов [6].

В отличие от нервных клеток глиальные клетки невозбудимы. Они имеют потенциалзависимые Na⁺– и Са²⁺–каналы, однако плотность каналов недостаточна для генерации потенциалов действия.

В некоторых глиальных клетках также имеются ионные каналы, активность которых контролируется синаптическими медиаторами, но функция этих каналов неясна.

Считалось, что поскольку глиальные клетки располагаются между капиллярами и нервными клетками (рис. 2.3), их функция заключается в обеспечении нейронов питательными веществами. Однако нейроны, по–видимому, не нуждаются в транспорте питательных веществ через глию; вполне достаточна диффузия этих веществ через межклеточные пространства. Большинство нейронов находится на расстоянии менее 50 мкм от ближайшего капилляра. Тем не менее многие вещества, которые содержатся в плазме крови, не могут проникнуть в межклеточные пространства и к нейронам из–за того, что они задерживаются гемато–энцефалическим барьером. Наличие такого барьера отчасти обусловлено тем, что в капиллярах мозга крайне немногочисленны характерные для капиллярного русла других тканей отверстия в эндотелии, которые могут пропускать достаточно крупные молекулы. Чтобы покинуть мозговой капилляр, вещество должно преодолеть путем диффузии или транспорта клетку эндотелия. Кроме того, после перехода через эндотелий вещество должно диффундировать на значительное расстояние вдоль отростков глиальных клеток. Во время такой диффузии глия может поглощать вещества, подлежащие удалению, так что они не причинят вреда. Видимо, глия представляет собой не столько источник снабжения нейронов, сколько средство защиты и механической опоры.

Na⁺/K⁺–насос. В разд. 1.2 разъяснялось, что хотя потенциал покоя в значительной степени обусловлен пассивной диффузией К⁺, составляющие его основу трансмембранные градиенты концентраций ионов не могут поддерживаться самостоятельно; они обеспечиваются Na⁺/K⁺–насосом с помощью процесса, требующего затраты энергии (рис. 1.9). Формирование градиентов концентраций включает общий сдвиг заряда, т. е. активность насоса является электрогенной и делает мембранный потенциал более отрицательным на 5–10 мВ. Следовательно, если активность насоса колеблется, то и потенциал покоя меняется на несколько милливольт. При блокировании насоса ядами или вследствие недостатка энергии электрогенный компонент мембранного потенциала исчезает; клетка медленно поглощает Na⁺ и теряет К⁺, а потенциал покоя постепенно смещается к более положительным значениям.

2.2. Потенциал действия

Функция нервных клеток в организме заключается в получении информации, передаче ее в другие отделы нервной системы, сопоставление

Рис. 2.4. Схематическое изображение потенциалов действия в различных тканях млекопитающих. Ордината: амплитуда внутриклеточного мембранного потенциала; абсцисса: время после начала потенциала действия. Временная шкала для каждого потенциала действия различна

информации от разных источников и, наконец, регуляции деятельности других клеток. Сигналы, поступающие от нервов, вызывают сокращение мышечных клеток. Когда эти два типа клеток «активны» (каждая по–своему), возникает быстрый сдвиг мембранного потенциала в положительном направлении–потенциал действия.

Временной ход потенциала действия

Потенциалы действия можно зарегистрировать в нервных и мышечных клетках с помощью внутриклеточных электродов (рис. 2.1). Типичные примеры потенциалов действия в различных тканях млекопитающих представлены на рис. 2.4. Во всех этих случаях потенциал резко нарастает от отрицательных значений потенциала покоя до положительного пика, составляющего примерно +30 мВ. Затем потенциал с различной скоростью возвращается к уровню покоя; длительность потенциала действия составляет около 1 мс в нервах, 10 мс в скелетной мышце и более 200 мс в миокарде.

Как показывает рис. 2.5, для потенциала действия характерны несколько фаз. Он начинается очень быстрым сдвигом потенциала в положительном направлении–фазой нарастания, которая продолжается всего лишь 0,2–0,5 мс. Во время фазы нарастания клеточная мембрана теряет свой нормальный заряд («поляризацию»); поэтому фазу нарастания называют также фазой деполяризации. Обычно кривая деполяризации переходит за нулевую линию и мембранный потенциал становится положительным. Эта положительная фаза потенциала действия называется овершутом («перелетом»). Следующая за овершутом фаза, в течение которой восстанавливается исходный потенциал покоя мембраны, называется реполяризацией.

Рис. 2.5. Временной ход потенциала действия в нейроне; показаны последовательные фазы потенциала действия, описанные в тексте

Следовые потенциалы. Последний участок фазы реполяризации для некоторых видов потенциалов действия бывает замедленным; хорошим примером служит потенциал действия мышцы на рис. 2.4. Приблизительно через 1 мс после начала потенциала действия наблюдается отчетливый перегиб кривой реполяризации; следующее за ним медленное изменение потенциала называется деполяризационным следовым потенциалом. В других тканях, например в нейронах спинного мозга, кривая деполяризации быстро пересекает уровень потенциала покоя, так что на некоторое время потенциал становится более отрицательным, чем потенциал покоя. Это явление получило название гиперполяризационный следовой потенциал (рис. 2.5).

Природа потенциала действия

Порог и возбудимость. Каким образом потенциал покоя, обычно поддерживаемый на постоянном уровне посредством только что обсуждавшихся механизмов, нарушается до такой степени, что возникает потенциал действия? Потенциалы действия генерируются при деполяризации мембраны от потенциала покоя до примерно —50 мВ. Механизмы развития этой начальной деполяризации будут рассмотрены позднее. Уровень потенциала, при котором деполяризация приводит к потенциалу действия, называется порогом (рис. 2.5). При таком пороговом потенциале заряд мембраны становится нестабильным; он нарушается посредством внутреннего механизма, который ведет к реверсии полярности–быстрому нарастанию потенциала действия до пика. Это состояние автоматического прогрессирующего нарушения мембранного заряда называется возбуждением. Обычно возбуждение продолжается менее 1 мс. Оно подобно взрыву–протекает мощно, но быстро завершается. После фазы деполяризации наступает процесс восстановления заряда мембраны, присущего состоянию покоя.

Клетки, в которых можно вызвать потенциалы действия, называются возбудимыми. Возбудимость является типичным свойством нервных и мышечных клеток. Клетки каждого типа характеризуются собственным постоянным временным ходом потенциала действия. Он практически не зависит от источника или частоты возбуждения клетки. Поскольку форма потенциала действия постоянна, говорят, что возбуждение протекает по закону «все или ничего».

Проводимость мембраны. Во время потенциала действия происходит кратковременное изменение проницаемости мембраны для ионов, определяющих величину потенциала покоя (уравнение 7). Когда речь идет об электрических свойствах мембраны, удобной мерой проницаемости мембраны для иона служит проводимость мембраны g_ion. Проводимость определяется отношением тока I_ion к движущему потенциалу. При равновесном потенциале для рассматриваемого иона, Е_ion (см. уравнение 4), движущий потенциал и суммарный ток равны нулю; следовательно, Е_ion является референтным потенциалом, и отклонение мембранного потенциала Е от Е_ion составляет ту разность потенциалов, которая создает ток I_ion. Следовательно, проводимость g_ion описывается уравнением

g_ion = I_ion /(E – Е_ion ) (1)

Теперь мы можем продолжить описание ионных токов во время потенциала действия, пользуясь только что введенным понятием проводимости для индивидуальных ионов.

Ионные токи во время потенциала действия. Потенциал покоя, как было показано в предыдущем разделе, очень близок к уровню равновесного потенциала для ионов К⁺ для которых мембрана в состоянии покоя наиболее проницаема. Если во время потенциала действия внутренняя среда клетки приобретает положительный заряд по отношению к внеклеточной среде, то проводимость мембраны для Na⁺ (gNa) должна возрастать, потому что только равновесный потенциал для Na⁺ имеет более положительное значение (+60 мВ), чем пик потенциала действия. Это заключение подтверждается экспериментальными данными, согласно которым потенциалы действия могут генерироваться только при высокой внеклеточной концентрации Na⁺. При недостатке внеклеточного Na ⁺ входящий натриевый ток не может нарастать, независимо от того, в какой мере увеличивается gNa, и, следовательно, не может развиваться деполяризационная фаза потенциала действия. Таким образом, в основе возбуждения лежит повышение проводимости мембраны для Na⁺, вызываемое ее деполяризацией до порогового уровня. Однако в данном случае затрагивается также и проводимость мембраны для К⁺. Если повышение проводимости для К⁺ предотвратить некоторыми веществами, например тетраэтиламмонием, мембрана после потенциала действия реполяризуется гораздо медленнее. Это показывает, что повышение проводимости для K⁺ является важным фактором реполяризации мембраны. Итак, потенциал действия обусловлен циклическим процессом поступления Na⁺ в клетку и последующего выхода К⁺ из нее.

Кинетика ионных токов во время возбуждения

Регистрация мембранных токов. Деполяризация, возникающая при возбуждении, изменяет проводимость мембраны для различных ионов, что в свою очередь вызывает изменение потенциала. Анализ этого сложного процесса производится путем оценки зависимости проводимости мембраны от мембранного потенциала. Ступенчатый сдвиг потенциала от базальной линии до тестирующего потенциала создается путем подведения к клетке тока, поступающего от электронного усилителя. Производится измерение тока, необходимого для такой «фиксации потенциала»; этот ток представляет собой зеркальное отражение тока, генерируемого клеточной мембраной в ответ на сдвиг потенциала [23, 24]. На рис. 2.6 показан временной ход мембранного тока в этих условиях для двух перехватов Ранвье нерва лягушки. Ступенчатые сдвиги от исходного потенциала до —60, —30, 0, +30 и +60 мВ вызывают комплексные токи, состоящие из суммы Na⁺–и К⁺–токов. Эти компоненты можно разделить, блокируя один из них специфическим ингибитором.

На рис. 2,6, Б представлены результаты после применения тетраэтиламмония (ТЭА) для блокирования К⁺–токов [33]; следовательно регистрируемые кривые здесь отражают Na⁺ токи. Эти Na⁺–токи отрицательны при тестирующих потенциалах ниже +40 мВ; ионы Na входят в нервные волокна. При +30 мВ Na⁺ токи все еще отрицательны, но их амплитуда мала, а при +60 мВ, по другую сторону от уровня равновесного потенциала для Na⁺, направление токов меняется. После каждого деполяризующего сдвига потенциала Na⁺ ток очень быстро достигает максимума, а затем, если деполяризация поддерживается, возвращается к нулю. Такая инактивация Na⁺–токов протекает наиболее медленно при небольших деполяризациях и ускоряется с увеличением деполяризации: при + 30 мВ Na⁺ –ток практически прекращается уже через 1 мс.

Эксперимент, результаты которого представлены на рис. 2.6, Б, был дополнен (рис. 2.6, Г) блокированием Na⁺–токов тетродотоксином (ТТХ) [35], чтобы выявить временной ход К⁺–токов. Зарегистрированные К⁺–токи положительны в пределах всего диапазона тестирующих потенциалов; равновесный потенциал для К⁺ находится на уровне около —100 мВ, так что при потенциалах от —60 мВ до +60 мВ К⁺–токи выходят из нерва. Амплитуда К⁺–токов возрастает примерно пропорционально величине деполяризации. Даже при самой большой деполяризации ток начинается с задержкой порядка 0,5 мс; в течение примерно 5 мс ток достигает плато и удерживается на этом уровне в течение всего периода деполяризации. В отличие от Na⁺–токов, К⁺–токи в нейронах не инактивируются. Другое важное различие между К⁺– и Na⁺–токами состоит в том, что Na⁺ток достигает максимума очень быстро после начала деполяризации, тогда как К⁺–ток возникает после некоторой задержки и затем нарастает относительно медленно.

Na⁺– и К⁺–проводимость во время потенциала действия.

Временной ход мембранной проводимости для Na⁺ и К⁺ можно рассчитать путем деления амплитуд соответствующих токов (рис. 2.6) на разность между тестирующим и равновесным потенциалами для соответствующего иона. Подобные данные можно также получить для небольших скачков потенциала. Пусть, например, известна амплитуда тока, вызванного маленьким скачком потенциала в околопороговом диапазоне. Этот ток протекает по мембранной емкости и идет через мембранное сопротивление, значения которых известны (см. рис. 2.16 и 2.17), вызывая небольшую деполяризацию. Этот потенциал в свою очередь вызывает дополнительный ток, который ведет к дальнейшей деполяризации и значение которого можно вычислить. Продолжая работать с такими небольшими скачками потенциала и временными отрезками, можно воспроизвести временной ход потенциала действия по зарегистрированным потенциалзависимостям амплитуд и временного хода gNa и gK. На рис. 2.7 изображен реконструированный таким образом потенциал действия, а также временной ход gNa и gK. При достижении порогового потенциала gNa резко нарастает; она достигает максимума раньше пика потенциала действия, поскольку уже начинается инактивация Na⁺–тока, и в течение 1 мс gNa возвращается к исходному уровню. Напротив, gK нарастает медленно, с некоторой задержкой после начала деполяризации. Она достигает своего максимума поздно, когда реполяризация уже наполовину завершена, и затем снижается, так как снижается деполяризация. Таким образом, повышение gK ускоряет вторую фазу реполяризации и служит причиной гиперполяризационного следового потенциала после потенциала действия (рис. 2.7); в то время как gK все еще превышает значение потенциала покоя, мембранный потенциал смещается от уровня покоя по направлению к отрицательному калиевому равновесному потенциалу Е_К.

Рис. 2.6. А и В. Мембранные токи в миелинизированных аксонах лягушки (перехваты Ранвье; 11–13°С) после ступенчатых сдвигов мембранного потенциала. Мембранный потенциал поддерживался с помощью фиксации потенциала на уровне потенциала покоя, равного —95 мВ; в момент времени 0 мс мембранный потенциал скачком поднимали до значений, которые указаны справа около записей тока, от —60 до +60 мВ. Сопровождающие скачок потенциала кратковременные емкостные токи вычитались, поэтому регистрируемые токи являются ионными токами. При —60 мВ скачок потенциала остается подпороговым и не вызывает изменений тока. По мере увеличения скачков потенциала сначала возникают отрицательные токи, которые с увеличением потенциала становятся положительными. Б. То же, что на рис. А, но на фоне блокады калиевых токов ТЭА (6 мМ), в результате чего токи почти полностью обеспечиваются ионами Na⁺. Полярность Na⁺–токов меняется с отрицательной на положительную между значениями +30 и +60 мВ; по мере увеличения деполяризации продолжительность Na^––токов уменьшается. Г. То же, что на рис. В, но на фоне блокады натриевых токов тетродотоксином (0,3 мкМ), так что записи соответствуют калиевым токам. При деполяризации K⁺–токи нарастают медленнее, чем Na⁺ токи, и продолжаются в течение всего периода деполяризации (по [3] с изменениями)

Рис. 2.7. Мембранные проводимости во время потенциала действия в гигантском аксоне кальмара, gNa и gk рассчитывали, подавая серии деполяризующих скачков потенциала (см. рис. 2.6) (по [6] с изменениями)

Инактивация Na⁺тoкa

Из рис. 2.6, Б видно, что Na⁺–ток в нерве лягушки начинает убывать примерно через 0,5 мс, несмотря на продолжающуюся деполяризацию. У гомойотермных животных, имеющих более высокую температуру тела, этот промежуток времени еще короче. Характерная для Na⁺–тока инактивация становится более быстрой по мере увеличения деполяризации, так что ток раньше возвращается к нулю. Однако этот процесс не означает восстановления состояния покоя; если мембрана на короткое время реполяризуется и снова деполяризуется после полной инактивации, в ней практически невозможно снова вызвать Na⁺–ток. При таком состоянии мембраны натриевая система не может быть активирована. Даже после того как на некоторое время восстановится потенциал покоя, Na⁺–ток можно активировать лишь частично. Только в случае предварительной гиперполяризации аксонной мембраны на 20–40 мВ последующая деполяризация от этого уровня потенциала способна вызвать максимальный Na⁺–ток, I Na⁺max (Рис. 2.8). Если мембранный потенциал на период 10 мс или дольше сместить на 20 мВ от потенциала покоя к более положительному значению, то деполяризация от этого исходного уровня приведет к возникновению только минимального Na⁺–тока. Следовательно, длительная деполяризация может предотвратить возбуждение; клетки, потенциал которых положительное уровня от —60, до —50 мВ, утрачивают возбудимость [3, 23]. Продолжительная деполяризация может развиваться в результате метаболических нарушений, например при кислородной недостаточности, а также под влиянием фармакологических препаратов; такая деполяризация способна блокировать генерирование процесса возбуждения.

Рефрактерные периоды. Еще одним важным следствием инактивации Na⁺ –системы является развитие рефрактерности мембраны. Это явление иллюстрирует рис. 2.9. Если мембрана деполяризуется сразу после развития потенциала действия, то возбуждение не возникает ни при значении потенциала, соответствующем порогу для предыдущего потенциала действия, ни при любой более сильной деполяризации. Такое состояние полной невозбудимости, которое в нервных клетках продолжается около 1 мс, называется абсолютным рефракторным периодом. За ним следует относительный рефракторный период, когда путем значительной деполяризации все же можно вызвать потенциал действия, хотя его амплитуда и снижена по сравнению с нормой. Потенциал действия обычной амплитуды при нормальной пороговой деполяризации можно вызвать только через несколько миллисекунд после предыдущего потенциала действия. Возвращение к нормальной ситуации соответствует окончанию относительного рефракторного периода. Как отмечалось выше, рефрактерность обусловлена инактивацией Na⁺–системы во время предшествующего потенциала действия. Хотя при реполяризации мембраны состояние инактивации заканчивается, такое восстановление представляет собой постепенный процесс, продолжающийся несколько миллисекунд, в течение которых Na⁺–система еще не способна активироваться или же активируется только частично. Абсолютный рефракторный период ограничивает максимальную частоту генерирования потенциалов действия. Если, как это показано на рис. 2.9, абсолютный рефракторный период завершается через 2 мс после начала потенциала действия, то клетка может

Рис. 2.8. Потенциалзависимая инактивация Na⁺ –системы. По оси абсцисс отложены величины отклонения мембранного потенциала от потенциала покоя (—60 мВ). От каждого из этих исходных значений потенциала мембрану деполяризовали до —16мВ и по оси ординат откладывали отношения возникающих максимальных Na⁺– токов (INa⁺ max) к величине INa⁺ max’, соответствующий полной активации Na⁺–системы (по [15] с изменениями)

Рис. 2.9. Рефрактерность после возбуждения. В нерве млекопитающего вызван потенциал действия (слева), после чего с различными интервалами наносили стимулы. Сплошной красной линией показан пороговый уровень потенциала, а черными прерывистыми линиями–деполяризация волокна до порогового уровня. В абсолютном рефракторном периоде волокно невозбудимо, а в относительном рефракторном периоде порог его возбуждения превышает нормальный уровень

возбуждаться с частотой максимум 500/с. Существуют клетки с еще более коротким рефракторным периодом, в них частота возбуждения может доходить до 1000/с. Однако большинство клеток имеет максимальную частоту потенциалов действия ниже 500/с.

Ионные токи во время следовых потенциалов

Во многих клетках после быстрой деполяризации, которая соответствует потенциалу действия, развиваются де– или гиперполяризационные следовые потенциалы (рис. 2.4 и 2.5). Природа таких следовых потенциалов может быть разной; кратко опишем два наиболее важных типа.

Кратковременный гиперполяризационный следовой потенциал наблюдается сразу после реполяризации во многих нервных клетках и в некоторых клетках миокарда (рис. 2.5). Этот следовой потенциал представляет собой избыточную реполяризацию; когда во время фазы реполяризации потенциал достигает уровня покоя, gK еще не возвращается к своему исходному уровню (рис. 2.7), т. е. gK в отличие от gNa превышает уровень покоя. Следовательно, мембранный потенциал ближе подходит к значению Е_K, чем это было в покое. Возникающая в результате гиперполяризация затухает по мере спада повышенного уровня gK. Такой механизм кратковременной гиперполяризации после потенциала действия участвует в развитии ритмического возбуждения; мы вернемся к нему ниже.

Длительные гиперполяризационные следовые потенциалы, которые суммируются при достаточно высокой частоте возбуждения, особенно хорошо выражены в тонких нервных волокнах позвоночных–волокнах группы IV. Такие длительные гиперполяризационные следовые потенциалы обеспечиваются электрогенным Nа⁺–насосом, который удаляет из клетки Na⁺, вошедший в нее во время возбуждения [28]. Они исчезают, если предотвратить активность насоса веществами, блокирующими метаболизм, например ДНФ (ср. рис. 1.7).

«Стабилизирующее» влияние [Са²⁺]_out на потенциал покоя. Зависимость от тестирующего потенциала, которую иллюстрирует рис. 2.6, может изменяться при различных воздействиях. Блокада некоторых Na⁺–каналов тетродотоксином или аналогично действующими веществами, а также изменения плотности Na⁺ –каналов в мембране влияют только на амплитуду, но не на зависимость от потенциала или временной ход Na⁺–токов. Характерные смещения зависимости мембранных токов от потенциала происходят при изменениях внеклеточной концентрации Са²⁺, [Са²⁺]_out. На рис. 2.10 графики зависимости максимальной Na⁺–проницаемости, от тестирующих потенциалов (абсцисса) построены при разных значениях [Са²⁺]_out. Графики для, построенные в логарифмическом масштабе, вначале имеют вид поднимающейся прямой, а затем выходят на уровень насыщения. Влияние [Са²⁺] _out заключается в параллельном смещении графиков зависимости от потенциала вдоль оси абсцисс: при [Са²⁺] _out = 0 небольшие деполяризации вызывают значительные изменения P_Na, тогда как при высоких [Са²⁺] _out такой же Na⁺ –ток может возникнуть только при деполяризации не менее чем на 35 мВ. Следовательно, снижение способствует генерированию потенциалов действия во время деполяризации. Влияние [Са²⁺]_out на P_Na, показанное на рис. 2.10, осложняется еще одним эффектом, действующим в том же направлении,– влиянием на зависимость инактивации от потенциала. Кривые зависимости INa⁺ max от исходного потенциала (рис. 2.8) при изменениях [Са²⁺]_out смещаются вдоль оси абсцисс точно таким же образом, как и кривые на рис. 2.10. В результате снижение [Са²⁺]_out сопровождается не только более значительным увеличением Р_Na,а в ответ на такую же деполяризацию (рис. 2.10), но и абсолютным уменьшением максимально возможного прироста INa⁺ (рис. 2.8). Общий эффект, однако, состоит в том, что уменьшение [Са²⁺]_out ведет к снижению порога генерации потенциала действия, т.е. повышает возбудимость, тогда как увеличение [Са²⁺]_out «стабилизирует» мембранный потенциал. Заметные локальные сдвиги не так уж необычны в организме; например, в ЦНС при усилении активности (особенно в синапсах) поступление Са²⁺ в клетки ведет к снижению в ограниченных межклеточных пространствах (рис. 2.3); возбудимость клеток повышается, что может сопровождаться генерированием разрядов судорожного типа [13]. Общее снижение [Са²⁺]_out в плазме крови вызывает синдром тетании, при котором нерегулируемое возбуждение мышц приводит к судорогам.

Удивительное параллельное смещение графиков потенциалзависимости Na⁺–токов (и других мембранных токов) при повышении [Са²⁺]_out интересно с физической точки зрения. Как показывает представленная на рис. 2.15 модель Na⁺ –канала, наружная сторона мембраны несет фиксированные заряды, главным образом отрицательные. Они принадлежат фосфо– и гликолипидам, а также гликопротеинам (рис. 1.2). Эти заряды удерживают около мембраны ионную оболочку, которая, по приблизительной оценке, обеспечивает примерно половину общего градиента мембранного потенциала, так что канальные белки «чувствуют» не более половины разности потенциалов, существующей между внутренней средой и наружной поверхностью клетки [3, 26]. Ионы Ca²⁺ взаимодействуют с фиксированными зарядами на поверхности плазматической мембраны, нейтрализуя их. Поэтому при высокой концентрации Са²⁺ общий наружный отрицательный заряд снижается, а отрицательный потенциал, действующий на ионные каналы, увеличивается. По этой причине для получения при 20 мМ [Са²⁺]_out такого же повышения Р_Na, что и при 2 мМ [Са²⁺]_out потребуется примерно на 20 мВ более значительная деполяризация. И наоборот, при снижении [Са²⁺]_out отрицательный поверхностный заряд возрастает и графики потенциалзависимости смещаются в сторону меньших значений деполяризации.

Эффекты поверхностных отрицательных зарядов рассматривались здесь не только для того, чтобы объяснить влияние изменений_. Смещения потенциалзависимости, аналогичные представленным на рис. 2.10, наблюдаются и при сдвигах внеклеточного рН. При снижении рН возрастает [Н⁺]out. что уменьшает отрицательный заряд поверхности мембраны–эффект, аналогичный результату повышения. Снижение рН до 4,5, так же как повышение на рис. 2.10, может вызвать смещение активации Р_Na на 25 мВ. Изменения рН тканей в зависимости от метаболизма вполне возможны. Состояние поверхностного заряда мембраны может также влиять на связывание и активность ионизированных веществ, действие которых аналогичным образом зависит от [Са²⁺]_out от рН [3, 26, 33].

Рис. 2.10. Зависимость максимальной Na⁺ –проницаемости, Р_Na, от величины скачков деполяризации. Перехват Ранвье был деполяризован от исходного мембранного потенциала —80 мВ до тестирующих потенциалов, отложенных по оси абсцисс. На вставке: деполяризация до тестирующего потенциала и возникающий в ответ Na⁺–ток, l_Na. Максимум l_Na определяет (вместе с внутри– и внеклеточной концентрациями Na⁺ и мембранным потенциалом) максимальную р],„ в соответствии с уравнением 7 (гл. 1). Кривые зависимости Р_Na, от потенциала смещаются вдоль оси абсцисс при изменениях внеклеточной концентрации Ca²⁺ ([Са²⁺]_out, от 0 до 20 мМ). При снижении [Са²⁺]_out пороговая деполяризация для повышения РNa⁺, уменьшается; происходит повышение возбудимости перехвата Ранвье (по [3] с изменениями)

2.3. Токи через потенциалзависимые мембранные каналы

Локальная фиксация потенциала мембраны.

До сих пор мы рассматривали токи и сдвиги проводимости всей мембраны при ее деполяризации. Несколько лет назад был разработан метод регистрации токов в микроучастках мембраны диаметром примерно 1 мкм, который позволяет идентифицировать молекулярные реакции одиночных каналов на основе зависимостей ионных токов от потенциала и времени. Рис. 2.11 иллюстрирует принцип локальной фиксации потенциала ("patch clamp") [12, 24]. Стеклянная микропипетка, диаметр кончика которой меньше 1 мкм, подводится к клетке вплоть до контакта с мембраной, и когда через пипетку подается отрицательное давление, пипетка обычно закупоривается участком мембраны; электрическое сопротивление между пипеткой и внеклеточным раствором возрастает скачком более чем до 1 ГОм (10⁹ Ом). В результате микроучасток мембраны электрически изолируется от остальной мембраны. Канал пипетки соединен с усилителем обратной связи, который обеспечивает регулирующую цепь для поддержания потенциала пипетки на заданном уровне. Ток, необходимый для стабилизации потенциала–«ток фиксации» – точно соответствует току, протекающему в каждый момент через микроучасток мембраны. Командный потенциал усилителя можно устанавливать произвольно, так что регистрация токов через микроучасток мембраны может осуществляться при различных мембранных потенциалах или после ступенчатых сдвигов потенциала.

Гигаомный контакт между пипеткой и мембраной настолько прочен, что после отведения пипетки микроучасток мембраны часто отрывается от клетки, оставаясь прикрепленным к кончику пипетки. В этом случае регистрацию можно производить в микроучастке мембраны, отделенном от клетки, причем цитоплазматическая поверхность этого участка может омываться любым нужным раствором. Путем искусных манипуляций микроучасток мембраны можно даже перевернуть на пипетке наружной стороной мембраны наружу. Тогда цитоплазматическую поверхность можно орошать раствором в пипетке, который должен примерно соответствовать внутриклеточной среде, а на наружную поверхность могут воздействовать растворы различного состава; такая конфигурация «наружной стороной наружу» („outside–out") очень полезна для тестирования реакций каналов мембраны на изменения состава внеклеточной среды, на медиаторы или на фармакологические средства внеклеточного действия. Достаточно прочный контакт между участком мембраны и кончиком пипетки может быть достигнут только при абсолютной чистоте стекла пипетки и мембраны. Образованию контакта могут мешать волокна соединительной ткани, которые обычно приходится удалять путем обработки мембраны такими ферментами, как коллагеназа [12].

Рис. 2.11. Схема локальной фиксации мембранного потенциала («пэтч–кламп»). Изображен продольный срез через регистрирующую микропипетку (обозначена черным цветом) с диаметром контактирующего с мембраной кончика ≈1 мкм. Если кончик электрода абсолютно чист и поверхность клетки освобождена от волокон соединительной ткани, то при подаче через пипетку отрицательного давления образуется тесный контакт, который создает электрическую изоляцию каналов находящегося в кончике пипетки микроучастка мембраны от остальной мембраны клетки (вставка). Таким способом можно регистрировать токи каналов с помощью усилителя обратной связи, соединенного с раствором электролита в пипетке (по [12, 24] с изменениями)

Токи через одиночные Na⁺–каналы. Токи через микроучасток мембраны, процедура регистрации которых показана на рис. 2.11, схематически представлены на рис. 2.12. Слева приведены 10 записей Na⁺–тока, при каждой из которых мембрана была деполяризована на период 14 мс. В каждом случае наблюдается только единственный короткий импульс тока с амплитудой — 1,6 пА; это ток, протекающий через одиночную белковую молекулу Na⁺–канала. Длительность импульсов тока, которая соответствует времени открытого состояния канала, значительно варьирует около среднего значения 0,7 мс. Моменты открывания также варьируют, но при суммировании многих одиночных отведении получается результирующий временной ход тока, который на рис. 2.12 вверху слева изображен под записью скачка потенциала. Судя по записи временного хода тока, вероятность открывания канала резко возрастает при деполяризации, достигает максимума через 1,5 мс, затем снижается и становится минимальной через 10 мс после скачка деполяризации. Такое уменьшение вероятности открывания канала после деполяризации соответствует инактивации суммарного Na⁺тока [8, 31]. Отсюда следует, что открывание Na⁺–каналов при деполяризации не является строго детерминированным процессом; скорее происходит повышение вероятности открывания канала, а после того как он открылся, существует определенная вероятность, что он снова закроется. Таким «стохастическим» поведением обладают химические реакции, так что различные состояния канала – «закрытое, но способное к активации», «открытое» и «закрытое инактивированное» (неспособное к активации) можно связать между собой посредством постоянных скорости, как и в случае химических реакций. Простейшая модель поведения Na⁺ –канала включает эти три состояния (рис. 2.13). Переход от закрытого и способного к активации в открытое состояние обеспечивается деполяризацией. Однако деполяризация ускоряет также и переход в инактивированное состояние, поэтому открытый канал подвергается быстрой инактивации и остается инактивированным, пока в результате ре– или гиперполяризации мембраны не вернется в закрытое, но способное к активации состояние. Равновесие между закрытым, но способным к активации и закрытым инактивированным состояниями тоже устанавливается посредством мембранного потенциала; это соотношение проявляется в виде зависимости от исходного потенциала способности Na⁺ токa к активации (рис. 2.8) [8].

Токи через одиночные К⁺–каналы. На рис. 2.12 справа схематически представлены токи одиночных К⁺–каналов, аналогично токам Na⁺–каналов (см. слева). Импульсы тока тоже имеют маленькую амплитуду (всего лишь +2 пА), а продолжительность открытого состояния канала варьирует вблизи среднего значения 5 мс. Однако в период открытого состояния К⁺–канал часто на короткое время закрывается, т. е. происходят быстрые осцилляции между открытым и закрытым состояниями. Такие «вспышки» открываний наблюдаются для многих типов каналов (с. 39 и 65). В отличие от Na⁺–канала, К⁺–канал не инактивируется во время деполяризации; пока продолжается деполяризация, индивидуальные каналы непрерывно открываются и закрываются. В соответствии с этим, при суммации отведении получается кривая К⁺–тока, которая нарастает до стационарного уровня. Таким образом, описывая поведение токов К⁺–каналов с помощью модели, представленной на рис. 2.13, следует отметить, что инактивированное состояние в данном случае отсутствует, но наблюдаются два последовательных закрытых состояния, которые обеспечивают прерывистый характер вспышек [34] (см. Са²⁺–канал).

Рис. 2.12 отражает поведение К⁺–каналов, типичное для нервных волокон: задержанное нарастание суммарного тока при деполяризации, заметное повышение проводимости во время деполяризации от

Рис. 2.12. Токи через натриевые (слева) и калиевые (справа) каналы (схематическое изображение). С помощью локальной фиксации потенциала производили сдвиг потенциала длительностью 14 мс от —80 до —40 мВ (черная линия); ниже показаны мембранные токи, зарегистрированные при нескольких таких последовательных сдвигах потенциала. Во время деполяризации токи одиночного канала могут возникать в любой момент, причем длительность их варьирует. При объединении многих записей токов в условиях синхронизации скачков потенциала получаются суммарные кривые токов, показанные вверху красным (I_Na и I_K). Временной ход I_Na свидетельствует о том, что вероятность открывания Na⁺–каналов наиболее высока вскоре после скачка потенциала, а примерно через 1 мс эти каналы открываются все реже и в конце концов инактивируются. Большая часть K⁺ –каналов открывается с некоторой задержкой после скачка потенциала, затем средняя частота открываний остается на постоянном уровне в течение всего периода деполяризации

потенциала покоя и отсутствие инактивации (ср. рис. 2.6). Обнаружено по крайней мере пять других типов К⁺–каналов. Они различаются, например, соотношением между открыванием канала и потенциалом мембраны, характеристиками инактивации (см. рис. 2.25) или же зависимостью не только от деполяризации, но и от внутриклеточной концентрации Са²⁺. Эти типы К⁺–каналов обнаружены в клетках различных типов или частях клетки и присутствуют либо по отдельности, либо в виде определенных сочетаний. Именно разнообразие К⁺–каналов обусловливает вариации формы потенциалов действия, а также различную скорость реполяризации и особенности следовых потенциалов (см. рис. 2.4). Существует яркий контраст между многообразием К⁺–каналов и одновременно Na⁺–каналов, которые в возбудимых клетках животных всех типов быстро активируются деполяризацией, а затем быстро инактивируются.

Токи через одиночные Са²⁺–каналы. До сих пор мы не упоминали о том, что при деполяризации клетки открываются также Са²⁺–каналы. При этом возникает входящий кальциевый ток, который вместе с одновременно развивающимся Na⁺–током обеспечивает деполяризацию мембраны. Концентрация свободных ионов Ca²⁺ в клетке очень низка (табл. 1.1), так что равновесный потенциал для Са²⁺ более положителен, чем Е _Na (гл. 1, уравнение 4). В аксонной мембране gCa меньше по сравнению с gNa, поэтому этой величиной можно пренебречь при анализе потенциала действия (рис. 2.7). Однако в дендритах нейронов или в окончаниях аксонов во время деполяризации gCa²⁺, может возрастать, превышая gNa⁺. В миокарде и тем более в гладких мышцах повышение gCa²⁺ бывает столь же велико, как и повышение gNa⁺, а иногда и более значительно. Такие входящие токи Ca²⁺ представляют особый интерес из–за их влияния на внутриклеточную концентрацию Са²⁺, которая может возрастать с 10^–7 до 10^–6 М; это повышение [Са²⁺]_out часто выполняет в клетке регулирующие функции (см. рис. 1.16). Механизм открывания Са²⁺–каналов и последующие внутриклеточные процессы являются филогенетически очень древними–они выявлены даже у простейших.

Рис. 2.13. Модель состояний Na⁺–каналов. «Закрытое, способное к активации» состояние при деполяризации может преобразовываться в «открытое активированное» или «закрытое инактивированное» состояние. Когда канал находится в «открытом активированном» состоянии, стойкая деполяризация способствует переходу в «закрытое инактивированное» состояние. Возвращение канала в «закрытое, способное к активации» состояние может происходить только в результате реполяризации. (Более реальная модель включает последовательно 3 «закрытых, способных к активации» и 4 «закрытых инактивированных» состояния [8].)

Токи одиночных Са²⁺–каналов в миокарде (рис. 2.14) характеризуются несколько более сложным поведением по сравнению с Na⁺ и К⁺–токами, показанными на рис. 2.12. Во время серий деполяризационных скачков потенциала примерно в 70% случаев возникают довольно длительные вспышки импульсов тока, каждый амплитудой около 1 пА, а в 30% случаев канал остается закрытым. Индивидуальные открывания во время вспышек продолжаются в среднем около 1 мс, а закрытые состояния между ними–только 0,2 мс. Суммарный Ca²⁺–тoк во время деполяризации (нижние записи на рис. 2.14) быстро нарастает и инактивируется с постоянной времени примерно 130 мс, причем общий ток определяется длительностью и частотой вспышек. Кинетику канала проще всего описать (в соответствии с рис. 2.13) следующим уравнением:

Закрытое состояние 1 «(Деполяризация) «Закрытое состояние 2«(Деполяризация) « Открытое состояние (2)

Здесь от переходов между «Закрытым состоянием 2» и «Открытым состоянием» зависит длительность и частота индивидуальных открываний, а от переходов между «Закрытым состоянием I» и

Рис. 2.14. А, Б. Токи одиночных кальциевых каналов в клетках миокарда. Вверху: деполяризация длительностью 600 мс от —70 до +10 мВ, создаваемая методом локальной фиксации потенциала. Ниже представлены 4 записи токов одиночного канала. А. В нормальных условиях деполяризация в 30% случаев не вызывает токов через канал (записи не представлены). Внизу: суммарный ток, полученный путем усреднения многих индивидуальных записей токов одиночного канала; видна инактивация Ca²⁺–тoкa после деполяризации. Б. В присутствии 1 мкМ адреналина группы открываний одиночного канала становятся продолжительнее; при этом деполяризация не вызывает открываний канала только в 20%. Адреналин не влияет на амплитуду токов одиночного канала, но амплитуда суммарного тока (внизу) значительно возрастает (по [32] с изменениями)

«Закрытым состоянием 2»–частота и длительность вспышек. Уравнение (2) требует дополнения, чтобы учесть инактивированное состояние, как показано на рис. 2.13 [32].

Записи активности Са²⁺–канала на рис. 2.14 служат также примером модуляции активности канала гормоном или медиатором. Адреналин, секретируемый корой надпочечников как «эрготропный гормон», поступает к сердцу с кровотоком; один из его эффектов состоит в увеличении частоты сердечных сокращений. Кроме того, он высвобождается (вместе с норадреналином) в качестве медиатора из симпатических нервов сердца, вызывая тот же эффект. В эксперименте, результаты которого приведены на рис. 2.14, Б, адреналин в концентрации 10^–6 M апплицировали на клетку миокарда. После этого деполяризация вызвала примерно в 80% случаев активность одиночных Са²⁺–каналов с повышенной частотой вспышек. Кратковременные открывания и закрывания каналов были такими же," как раньше. Суммарная кривая (рис. 2.14,Б, внизу) отчетливо показывает, что адреналин увеличивал вход Са²⁺. Такой же эффект можно вызвать перфузией клеток миокарда раствором с циклическим аденозинмонофосфатом (цАМФ) или применением каталитической субъединицы цАМФ–зависимой протеинкиназы (ПК–А). Эти наблюдения свидетельствуют, что адреналин действует здесь через второй посредник–цАМФ, вызывая фосфорилирование ферментов каталитической субъединицей протеинкиназы (рис. 1.15) [19]. Таким образом, адреналин, по–видимому, увеличивает Са²⁺–ток путем инициации фосфорилирования Са²⁺ –канала, которое способствует переходу из «Закрытого состояния I» в «Закрытое состояние 2». Эффект адреналина, представленный на рис. 2.14, может служить прототипом модуляции клеточной активности гормонами или медиаторами.

В мембране, несомненно, существуют еще и С1^–каналы. Они изучены недостаточно подробно, поэтому рассматриваться здесь не будут.

Молекулы Na⁺–канала. Белки различных каналов очень сходны между собой по структуре и функциям; полагают, что все они происходят от Са²⁺–канала. Поскольку наиболее тщательно исследована молекула Na⁺–канала, мы вновь обратимся к нему. Na⁺ –канал состоит из гликопротеина с молекулярной массой ~ 300 000. Недавно установлена его аминокислотная последовательность. Изолированные молекулы можно включить в искусственные липидные мембраны, где они продолжают функционировать [8]. Число имеющихся в мембране Na⁺–каналов можно определить путем «титрования» тетродотоксином, который связывается с этими каналами, или путем деления величины Nа⁺ тока через мембрану площадью 1 мкм² на амплитуду тока одного канала. Разные типы мембран содержат от 1 до 50 каналов на 1 мкм². При плотности 50 каналов–мкм² среднее расстояние между ними составляет около 140 нм. Если принять диаметр молекулы канала равным примерно 8 нм, а диаметр просвета канала, когда он открыт,– около 0,5 нм, то оказывается, что каналы находятся друг от друга довольно далеко.

В течение 1 мс открытого состояния через один такой канал входит примерно 1 пА тока, перенося заряд, равный 10^–15 Кл. Емкость мембраны обычно равна 1 мкф–см² или 10^–14 Ф–мкм². Поскольку 1Ф = 1 Кл/В, заряд величиной 10^–15 Кл–мкм², который входит в клетку за время одного открывания каналов, достаточен для смещения мембранного потенциала на 100 мВ; иными словами, такой заряд обеспечивает фазу нарастания потенциала действия. Заряд величиной 10^–15 Кл переносит 6000 ионов Na⁺ Повышение внутриклеточной концентрации, обусловленное поступлением 6000 ионов Na⁺ в примембранную область объемом 1 мкм³, пренебрежимо мало, 10^–5 М. Следовательно, токи каналов достаточно велики для обеспечения генерации потенциала действия, но не создают заметных изменений внутриклеточных концентраций ионов (за исключением [Са²⁺],). Таким образом, восстановление трансмембранных ионных градиентов посредством Na⁺/K⁺–насоса не играет роли в случае одиночного потенциала действия.

Белок Na⁺–канала должен быть способен не только быстро включать массивный поток Na⁺, но и предотвращать одновременный вход других ионов, особенно K⁺, которые имеют почти те же размеры. Значит, Na⁺–каналы должны характеризоваться избирательностью. Что касается анионов, то они удерживаются отрицательными зарядами у входа в канал, как это показано на схеме (рис. 2.15). Из мелких катионов Li⁺ проходит через Na⁺ –канал относительно хорошо, тогда как К⁺ практически не пропускается. Избирательность можно объяснить только специфическим связыванием иона во время его прохождения через канал, о чем уже говорилось при обсуждении энергетического уровня связывания вдоль канала (рис. 1,5,Б) [21].

Кроме избирательности для Na⁺, Na⁺–канал должен обладать способностью быстро изменять свою проницаемость при изменениях мембранного потенциала. Следовательно, молекула Na⁺–канала должна нести заряды, которые могут смещаться под влиянием сдвигов силы электрического поля через мембрану. Смещения этих зарядов регистрируются в виде «воротных токов» [3, 9, 23] после полной блокады ионных каналов; воротные токи свидетельствуют о смещении по крайней мере 4 зарядов на канал. Эти 4 заряда представлены на рис. 2.15 как «датчик электрического поля», способствующий изменению конформации молекулы, при котором канал открывается. Открытое состояние нестабильно и преобразуется спонтанно в закрытое инактивированное состояние. Инактивация осуществляется участками канального белка, находящимися на внутренней стороне мембраны. Вещества, которые действуют внутриклеточно, например иодат или проназа, а также специфические токсины и фармакологические препараты, могут блокировать инактивацию.

Еще один способ блокады Na⁺–канала представляет интерес для медицины. Местные анестетики используются для предотвращения генерирования и распространения возбуждения в нервах, с тем чтобы потенциалы действия от «болевых рецепторов» не поступали в ЦНС. Анестетики обычно вводят около того нерва, который нужно блокировать. Однако их молекулы связываются только с открытыми каналами, в участке между входом в селективную пору и «воротами» (рис. 2.15) [25, 30]. Молекулы местных анестетиков слишком велики, чтобы войти в устье канала с наружной стороны мембраны. Они могут входить в открытый канал только с внутренней стороны мембраны или же, если они жирорастворимы, через липидную мембрану. Вызываемые ими закрывания канала часто продолжаются только несколько миллисекунд, но повторяются с высокой частотой; разбивая ток одиночного канала на много коротких фрагментов, анестетики делают вход Na⁺ неэффективным.

2.4. Электротон и стимул

Обсудив молекулярные основы возбуждения, вернемся к макроскопическому поведению нервных клеток. Возбуждение возникает при деполяризации мембраны до или выше порогового уровня; этот процесс называется также стимуляцией, или раздражением. Как правило, стимулом служит приложенный извне электрический ток, во время протекания которого происходит деполяризация мембраны. Поэтому прежде чем рассмотреть, каким образом стимул вызывает возбуждение, обратимся к процессу деполяризации мембраны электрическим током, начиная с таких небольших сдвигов потенциала, которые не изменяют проводимость мембраны.

Электротон в случае равномерного распределения тока

Простейшую модель для изучения ответов мембраны на прохождение тока представляет собой сферическая клетка; для приложения тока и регистрации мембранного потенциала служат внутриклеточные электроды (рис. 2.16, А). При включении постоянного тока положительного направления (рис. 2,16,Б) входящие в клетку положительные заряды постепенно разряжают мембранную емкость и

Рис. 2.15. Модель Na⁺–канала в мембране. Компоненты мембраны и ионы изображены в приближенном масштабе. Ионы Na⁺ проходят через пору; прерывистыми стрелками показано место действия ингибиторов–тетродотоксина (ТТХ, блокирует вход в пору) и проназы или иодата (предотвращают инактивацию) (по [9, 14] с изменениями)

таким образом деполяризуют мембрану. Соответственно отводящий электрод регистрирует быструю деполяризацию в начале импульса тока. Однако очень скоро деполяризация замедляется, поскольку при смещении мембранного потенциала от уровня потенциала покоя нарушается равновесие ионных потоков, и во время деполяризации больше ионов K⁺ покидает клетку. Этот противоположный поток положительных ионов через мембрану удаляет какую–то долю заряда, внесенного электрическим током, и разряд мембранной емкости замедляется. В конце концов деполяризация при постепенном уменьшении ее скорости достигает конечного уровня, при котором ионный ток через мембрану равен электрическому току, приложенному с помощью электрода, и тогда дальнейший разряд мембранной емкости прекращается (рис. 2.16). Сдвиг потенциала, вызываемый импульсом тока, называется электротоническим потенциалом, или электротоном. Конечный уровень, или амплитуда электротонического потенциала, пропорционален сопротивлению мембраны (величине, обратной проводимости мембраны) ионным токам. Скорость нарастания электротонического потенциала в самом начале определяется только емкостью мембраны; в это время протекает только емкостной ток. Когда возникает противоположно направленный поток ионов через мембрану, потенциал начинает экспоненциально меняться с показателем – t/τ, где t– время, а τ –постоянная времени, равная произведению сопротивления и емкости мембраны. В разных клетках τ составляет от 5 до 50 мс.

Рис.2.16. А, Б. Электротонический потенциал в клетке сферической формы. А. Внутриклеточные электроды служат для регистрации мембранного потенциала Е и пропускания тока I, распределение которого показано красными стрелками. 6. Временной ход импульса тока и одновременно регистрируемого электротонического потенциала в клетке. Постоянная времени т электротонического потенциала определяется временем, в течение которого потенциал доходит до уровня, достигающего 37% (1/е) его конечной амплитуды

Такая экспоненциальная кривая, как график электротона (или, например, спад радиоактивности изотопа), описывается выражением е^–t/τ. τ называется постоянной времени, поскольку при t, равном τ, показатель степени равен — 1. Следовательно, с помощью такой кривой можно определить τ, найдя на оси абсцисс время, за которое амплитуда падает до е^–1 = 1/е = 37% начальной величины.

Электротон в клетках вытянутой формы

Почти все нервные и мышечные клетки имеют большую длину по сравнению с их диаметром; так, нервное волокно может быть длиной до 1 м при диаметре всего около 1 мкм. Выходя из такой клетки, пропускаемый через нее ток будет распределяться очень неравномерно, т. е. ситуация будет сильно отличаться от представленной на рис. 2.16. Электротонические потенциалы в имеющем вытянутую форму мышечном волокне в месте пропускания тока (Е₀) и на расстоянии 2,5 и 5 мм (Е_2,5 ; и Е₅) показаны на рис. 1.20. Эти кривые отличаются по форме от изображенных на рис. 2.16; они не описываются простой экспонентой и зависят от расстояния. Е₀ в месте пропускания тока нарастает очень быстро, так что через промежуток времени, соответствующий постоянной времени τ, он не превышает 16% от своего конечного уровня (вместо 37% на рис. 2,16). Более крутое нарастание обусловлено неравномерным распределением тока; сначала мембранный конденсатор разряжается в небольшом

Рис. 2.17. Электротонические потенциалы в клетке вытянутой формы. Вверху: инъекция тока 2 в мышечную клетку; электротонические потенциалы регистрируются на расстояниях 0; 2,5 и 5 мм. В середине: временной ход электротонических потенциалов при этих трех расстояниях; в каждом случае потенциал достигает разного конечного уровня Е_max. Внизу: зависимость Е_max от расстояния до места инъекции тока. Постоянная длины мембраны λ равна расстоянию, при котором Е_max, падает до уровня 37% (1/е) амплитуды в месте пропускания тока

участке около источника тока, и только после этого ток начинает проходить внутри клетки, которая имеет значительное продольное сопротивление, к более удаленным участкам мембраны. Здесь мембранный конденсатор должен снова разрядиться, прежде чем начнет протекать ток, так что по мере увеличения расстояния от источника тока временной ход электротонического потенциала постепенно замедляется. На рис. 2,17 электротонический потенциал на расстоянии 5 мм от токового электрода (Е₅) возникает с заметной задержкой и даже через 120 мс не достигает своего конечного уровня Е_max[17].

Даже в том случае, если пропускаемый ток идет так долго, что происходит перераспределение заряда, через мембрану около точки введения токового электрода протекает более значительный ток, чем на расстоянии, поскольку в более удаленных точках ток должен преодолеть не только сопротивление мембраны, но также продольное сопротивление внутренней среды клетки. Конечный уровень электротонического потенциала Е_max в зависимости от расстояния от токового электрода показан на нижнем графике рис. 2.17. Е_max экспоненциально падает с расстоянием х, причем экспоненциальный показатель равен —х/λ. Величина называется постоянной длины мембраны; на рис. 2.17 она равна 2,5 мм, а в других клетках колеблется в пределах от 0,1 до 5 мм. Постоянная длины служит мерой расстояния, на которое электротонические потенциалы могут распространяться в клетках вытянутой формы. Например, на расстоянии 4 λ амплитуда электротонического потенциала составляет только 2% от его амплитуды у точки пропускания тока; следовательно, электротонические потенциалы в нерве можно зарегистрировать на расстоянии не более нескольких сантиметров от места их возникновения.

Следует еще раз подчеркнуть, что такое рассуждение относительно эффектов пропускаемого тока справедливо лишь для столь малых сдвигов потенциала, которые не изменяют ионную проводимость мембраны, т.е. наличие электротонических потенциалов подразумевает пассивное поведение мембраны. Поэтому при изменении полярности пропускаемого тока возникает электротонический потенциал, который соответствует зеркальному отражению прежнего потенциала.

Поляризация мембраны с помощью внеклеточных электродов. Пропускание тока через внутриклеточный электрод, как показано на рис. 2.16 и 2.17, создает простую ситуацию протекания тока, которая помогает понять явление электротона. Однако в медицинских исследованиях и в неврологической практике клетки обычно поляризуют с помощью внеклеточных электродов. Как правило, нервное волокно помещают на два металлических электрода, соединенных с источником напряжения. Протекание тока показано на рис. 2.18. Положительный электрод называется анодом, а отрицательный –катодом. Ток протекает от одного электрода к другому через тонкий слой жидкости, прилегающий к волокну, но поскольку внутренняя среда волокна тоже обладает относительно низким сопротивлением, ток у анода частично входит через мембрану, протекает через клетку к катоду и там вновь выходит через мембрану. Эти трансмембранные токи сопровождаются изменениями мембранного потенциала; у анода положительные заряды, поступающие к наружной поверхности мембраны, увеличивают заряд мембранного конденсатора и, следовательно, увеличивают мембранный потенциал. В результате ионы К⁺ входят в клетку, перенося ток через мембрану. При этом мембрана у анода гиперполяризуется. Противоположный по направлению сдвиг, деполяризация, происходит у катода. Профиль потенциала вдоль нервного волокна показан на рис. 2.18 внизу. Сдвиг потенциала максимален в участке

Рис. 2.18. Схема внеклеточной аппликации тока. Ток идет от анода к катоду (оба электрода находятся вне нерва), частично через пленку жидкости на поверхности нерва, а частично через оболочку нерва и в продольном направлении внутри волокна. Кривая внизу показывает изменения мембранного потенциала нервного волокна, вызываемые этим током (по [20] с изменениями)

наибольшей плотности тока, непосредственно под электродами. Обычно ток пропускают через нерв или мышцу с целью вызвать деполяризацию и таким образом стимулировать клетку, тогда как гиперполяризация в области анода нежелательна. В этом случае лучше использовать анод с большой поверхностью или поместить его на расстоянии от нерва, чтобы плотность тока у анода была меньше и гиперполяризация клетки, хотя и на большой площади, имела бы более низкую амплитуду. Электрод с малой поверхностью, у которого концентрируются силовые линии тока и поляризации, называется стимулирующим электродом, а электрод с большой поверхностью, имеющий противоположную полярность, называется индифферентным.

Стимул и порог

Когда деполяризующий электротонический потенциал превысит пороговый уровень, возникает возбуждение. Импульс тока, вызывающий сдвиг потенциала, называется стимулом. Поскольку мембрана обладает определенной электрической емкостью, изменение потенциала, производимое импульсом тока, происходит с некоторой задержкой (рис. 2.17). По этой причине потенциал достигает порога обычно через несколько миллисекунд после включения стимула. Чтобы стимул достиг порога, он должен продолжаться достаточно долго; следовательно, импульс тока должен иметь адекватные длительность и амплитуду. До определенного предела высокая амплитуда стимула может компенсировать его небольшую длительность.

Околопороговые стимулы. Деполяризация дендритов и тел нервных клеток часто едва достигает порогового уровня, поэтому от очень небольших различий ее интенсивности зависит, перейдет ли информация в форму потенциала действия или нет. Генерирование потенциала действия при достижении порога происходит потому, что деполяризация вызывает повышение Na⁺ проводимости, gNa, и возникающий в результате поток Na⁺ в клетку становится таким большим, что мембрана продолжает деполяризовываться автоматически. Однако поступление Na⁺ вызываемое деполяризацией, начинается не точно на пороговом уровне потенциала, а на несколько милливольт ниже. Это можно видеть в последовательной серии электротонических потенциалов, которая представлена на рис. 2.19; потенциалы вызываются гиперполяризующими и деполяризующими импульсами тока, которые постепенно увеличиваются. Только два самых маленьких по амплитуде деполяризационных электротонических потенциала являются зеркальным отражением гиперполяризационных потенциалов. Третий и четвертый деполяризационные потенциалы нарастают быстрее и достигают большей амплитуды, чем соответствующие гиперполяризационные потенциалы, а пятый деполяризационный потенциал становится надпороговым. Добавочная (по сравнению с зеркальным отражением гиперполяризационных потенциалов) деполяризация на кривых, близких к пороговому уровню, на рис. 2.19 обозначена розовым цветом; эта деполяризация называется локальным ответом и обусловлена повышением Na⁺–проводимости в этом диапазоне значений потенциала. Во время таких локальных ответов вход Na⁺ может существенно превосходить выход К⁺, однако Na⁺–ток еще не так велик, чтобы деполяризация мембраны стала достаточно быстрой для генерирования потенциала действия–т.е. для преодоления медленной инактивации в околопороговой области потенциалов (см. рис. 2.6,—60 мВ). Возбуждение развивается не полностью, иными словами, оно остается локальным процессом и не распространяется.

Электрические токи имеют значение для нейрофизиологии не только в связи с их использованием для стимуляции нервов; пропускание токов через кожу можно производить в лечебных целях, и иногда они становятся причиной несчастного случая. Постоянный ток действует как стимул главным образом в момент включения и выключения, хотя сильный стимул может повысить температуру ткани до такой степени, что произойдет ее повреждение, а при высоком напряжении могут возникать искровые разряды, вызывающие образование на коже глубоких ран. Низкочастотный переменный ток (например, 50 Гц) оказывает такое же воздействие, но с несколько меньшей тенденцией к возникновению искровых разрядов. Он тоже стимулирует возбудимые ткани, причем частота стимуляции соответствует частоте синусоидальных колебаний тока; такие стимулы, особенно если они поступают во время относительного рефракторного периода потенциала действия миокарда (фаза повышенной уязвимости), могут легко

Рис. 2.19. Электротонические потенциалы и локальные ответы. Гиперполяризующие стимулы тока (длительностью 4 мс) с относительной амплитудой 1, 2, 3, 4 и 5 вызывают пропорциональные по амплитуде электротонические потенциалы. При деполяризующих токах с амплитудой 1 и 2 возникающие потенциалы являются зеркальным отражением потенциалов при соответствующих гиперполяризующих токах. При деполяризующих импульсах с амплитудой 3 и 4 электротонические потенциалы превышают те потенциалы, которые возникают при деполяризации менее —70 мВ (область превышения под кривыми выделена розовым цветом). Ток с амплитудой 5 производит деполяризацию, которая достигает порога и вызывает потенциал действия

вызвать летальную фибрилляцию сердца. По этой причине низкочастотный переменный ток особенно опасен. Высокочастотный переменный ток (> 10 кГц) в течение половины своего цикла не может деполяризовать мембрану до порога, а следующая половина цикла уже снимает деполяризацию, так что эти токи не могут действовать как стимулы, а только вызывают нагревание ткани. Поэтому токи с частотой от 0,5 до 1 МГц можно применять в лечебных целях; такая диатермия используется для регулируемого местного прогревания ткани.

2.5. Распространение потенциала действия

Роль мембран нервного и мышечного волокна состоит в распространении информации (или регулирующих сигналов), т.е. в проведении возбуждения. Чтобы понять механизм проведения возбуждения, следует проблемы физиологии возбуждения, изложенные в разд. 2.2, рассмотреть в свете законов продольного распространения токов и потенциалов (разд. 2.3). Начнем с описания процесса распространения возбуждения в нерве.

Измерение скорости проведения

При возбуждении нерва (например, импульсом электрического тока) можно с помощью внеклеточных электродов зарегистрировать потенциалы действия (рис. 2.20). Такие потенциалы действия появляются не только в месте раздражения, но и на значительных расстояниях от него–например, на расстоянии примерно 1 м. На всем протяжении нерва потенциалы имеют одинаковую амплитуду, но появляются с задержкой, которая пропорциональна расстоянию от места нанесения стимула. В двигательном нерве, например, потенциал действия поступает в участок, удаленный на 1 м от места раздражения, через 10 мс; отсюда следует, что он проводится по нерву со скоростью 100 м/с.

На рис. 2.20 показана схема отведения с помощью внеклеточных электродов. Два электрода контактируют с нервным волокном, участок которого освобожден от окружающей ткани и помещен в электрически изолирующую среду, например в минеральное масло или воздух. При распространении волны возбуждения вдоль волокна справа налево она достигает электрода 1; поверхность волокна под этим электродом теряет свой положительный заряд и становится более отрицательной по отношению к участку под электродом 2, так что измерительный прибор показывает положительный сдвиг потенциала, временной ход которого примерно соответствует внутриклеточному потенциалу действия. Когда возбуждение достигнет электрода 2, прибор зарегистрирует сдвиг потенциала противоположной полярности, т.е. отрицательный потенциал действия. Поскольку общее колебание потенциала, регистрируемое двумя электродами, имеет положительный и отрицательный компоненты, его называют двухфазным потенциалом действия. Зная время между положительным и отрицательным пиками и расстояние между регистрирующими электродами, можно вычислить скорость проведения. Обычно две фазы потенциала действия не бывают разделены так четко, как на рис. 2.20. При скорости проведения, равной 100 м/c, и длительности потенциала действия 1 мс, например, потенциал действия захватывает участок нервного волокна длиной 100 м (100 м/с x 1 мс), так что для полного разделения фаз двухфазного потенциала действия потребовалось бы выделить участок нерва длиной 20 см. Как правило, это невозможно, поэтому две фазы двухфазного потенциала действия обычно накладываются друг на друга.

С помощью внеклеточных электродов можно также осуществить монофазное отведение. Если нерв повредить или деполяризовать раствором с повышенной концентрацией K⁺, чтобы предотвратить проведение потенциала действия от электрода 1 до электрода 2 (рис. 2.20), то регистрируется только

Рис. 2.20. Регистрация потенциала действия внеклеточными электродами. Проведение потенциала происходит справа налево (вверху) и область возбуждения доходит до электрода 1; регистрируемый потенциал показан сплошной красной линией (посередине). Когда потенциал действия достигает электрода 2, регистрируется изменение потенциала, показанное прерывистой красной линией. Каждое отклонение этой красной линии представляет собой монофазный потенциал действия. Два отклонения вместе составляют двухфазный потенциал действия, изображенный внизу как функция времени

колебание потенциала, показанное красной линией –монофазный потенциал действия. Чисто монофазные потенциалы, хотя и очень низкой амплитуды, можно также зарегистрировать с помощью одиночного микроэлектрода, который помещают около возбужденного нерва или нервной клетки; в этом случае индифферентный электрод должен быть удален от возбужденного участка и помещен в окружающей жидкости или в тканях животного. При таком «монополярном отведении» измеряется разность потенциалов между окружающим внеклеточным раствором и «землей», создаваемая местными токами в нервном волокне. Поэтому временной ход регистрируемых сдвигов потенциала соответствует динамике мембранного тока во время возбуждения (рис. 2.22). Для монополярного внеклеточного отведения необязательна изоляция возбужденной структуры, так что метод особенно полезен при изучении физиологии ЦНС.

Составной потенциал действия в смешанном нерве.

Нерв нижней конечности, например, содержит волокна, широко различающиеся по функциям, диаметру и скорости проведения. Если электрод расположен так, что контактирует с целым нервом, то при стимуляции нерва на некотором расстоянии от места отведения электрод сначала зарегистрирует потенциалы действия наиболее быстро проводящих волокон, а после этого–группы потенциалов других, более медленно проводящих волокон. Следовательно, потенциал действия такого нерва состоит из ответов целого спектра групп волокон с разными скоростями проведения (рис. 2.21). Индивидуальные зубцы такого составного потенциала действия принадлежат определенным группам волокон, которые вместе с их функциями перечислены в табл. 2.1, а. Эта классификация, предложенная Эрлангером и Гассером [II], включает как двигательные, так и сенсорные волокна. Широко применяется также классификация Ллойда–Ханта [22] для сенсорных нервов, которая представлена в табл. 2.1,б.

Механизм проведения

Для составного потенциала действия характерно полное возбуждение каждой точки нервного волокна, так что амплитуда потенциала действия везде одна и та же. Протекающие по принципу «все или ничего» процессы возбуждения в отдельных участках мембраны сопряжены друг с другом посредством электротонического распространения раздражающих токов вдоль волокна. Ионы Na⁺, входящие в волокно в возбужденном участке мембраны, служат источником тока для возникновения электротонического деполяризационного потенциала в соседнем, еще не возбужденном участке. Когда эта деполяризация достигает порога, она вызывает в этом участке возбуждение. Таким образом, состояние возбуждения распространяется посредством электротонической связи от возбужденных участков мембраны к еще не возбужденным.

Рис. 2.21. Составной потенциал действия подкожного нерва млекопитающего, зарегистрированный с помощью внеклеточного электрода. Все волокна нерва одновременно подвергаются стимуляции на некотором расстоянии от участка отведения. До участка отведения в первую очередь доходят потенциалы действия наиболее быстро проводящих волокон группы А; потенциалы действия медленных волокон группы С появляются примерно через 38 мс. Вслед за колебанием потенциала, соответствующим волокнам группы С, возникает продолжительный гиперполяризующий следовой потенциал. Отдельные зубцы волны, соответствующей А–волокнам, отражают активность волокон подгрупп α,β,γ,δ (по [29])

Таблица 2.1,a. Классификация нервных волокон по Эрлангеру–Гассеру

Тип волокна	Функции (выборочно)	Средний диаметр, мкм	Средняя скорость проведения, м/с
А α	Первичные афференты мышечных веретен, двигательные волокна скелетных мышц	15	100 (70–120)
А β	Кожные афференты прикосновения и давления	8	50 (30–70)
А γ	Двигательные волокна мышечных веретен	5	20 (15–30)
А δ	Кожные афференты температуры и боли	<3	15 (12–30)
В	Симпатические преганглионарные волокна	3	7 (3–15)
С	Кожные афференты боли	1	1 (0,5–2)
	Симпатические постганглионарные волокна	(немиелинизированные)

Таблица 2.1,б. Классификация нервных волокон по Ллойду–Ханту

Группа	Функции (выборочно)	Средний диаметр, мкм	Средняя скорость проведения, м/с
I	Первичные афференты мышечных веретен и афференты от сухожильных органов	13	75 (70–120)
II	Кожные механорецепторы	9	55 (25–70)
III	Мышечные афференты глубокого давления	3	11 (10–25)
IV	Немиелинизированные афференты боли	1	1

Отметим принципиальное различие между проведением потенциала действия и передачей колебаний напряжения по телеграфным проводам. По проводам ток течет от одного полюса источника напряжения к другому. Амплитуда колебания напряжения падает с расстоянием. С позиций электрофизиологии такое проведение является чисто электротоническим процессом. Во время проведения потенциала действия полюсы источника напряжения в каждом участке мембраны находятся внутри и снаружи волокна и ток представляет собой чисто мембранный ток, который протекает перпендикулярно направлению распространения потенциала действия.

Мембранные токи во время распространяющегося потенциала действия. На рис. 2.22 представлен «моментальный снимок» потенциала и тока вдоль нервного волокна во время проведения потенциала действия справа налево. Длина участка волокна, занятого потенциалом действия, зависит от скорости проведения; при скорости 100 м/с и длительности потенциала действия 1 мс длина оси абсцисс на рис. 2.22 будет соответствовать 10 см. Участок волокна между линиями А и В полностью возбужден;

вход Na⁺ вызванный резким повышением gNa, быстро разряжает емкость мембраны, и после пика повышенная gNa и возникающий в результате выход К⁺ ведут к реполяризации. Между линиями А и В мембранный ток I_m обусловлен преимущественно входом положительных зарядов; избыток положительных зарядов уходит, как показано в верхней части рис. 2.22, по обе стороны через внутреннюю среду волокна. Этот избыточный ток характерен для распространяющегося потенциала действия. В случае нераспространяющегося потенциала действия в изолированном участке мембраны входящий ток в момент пика потенциала действия отсутствует, поскольку вход Na⁺ равен выходу К⁺ . В момент пика распространяющегося потенциала действия общий входящий поток ионов все еще составляет около 80% от максимального; этот ток необходим для процесса электротонического распространения вдоль волокна.

Область потенциала действия, критически важная для его распространения, находится слева от линии А на рис. 2.22. В этом участке мембраны ток I_m, выходит из волокна и электротонически деполяризует мембрану. Источником тока для электротонической деполяризации служит возбужденный участок мембраны около линии Б. Электротоническая деполяризация в начале потенциала действия достигает пороговой области около линии А; при этом gNa возрастает, усиливается вход Na⁺ в клетку и возникает возбуждение. Начальная фаза потенциала действия представляет собой электротонический процесс, и скорость проведения потенциала зависит, следовательно, от постоянных времени и длины, τ и λ, которые характеризуют распространение электротонических потенциалов. В конце потенциала действия (справа от линии В на рис. 2.22) существует также выходящий ток I_m,

Рис. 2.22. Проведение потенциала действия. Черными линиями показан временной ход потенциала действия и проводимостей мембраны gNa и gK. Красной линией показан мембранный ток Im. Силовые линии распространения тока в волокне и вокруг него схематически изображены вверху. Вертикальными прерывистыми линиями отмечены моменты, соответствующие максимальной скорости нарастания потенциала действия (A), пика (Б) и максимальной скорости реполяризации (В) (по [27])

который стремится деполяризовать мембрану. В случае распространяющегося потенциала действия эта деполяризация предотвращается высоким значением gK в этом участке мембраны. Однако если gK относительно низка и добавляются эффекты других деполяризующих влияний, то электротонические мембранные токи в конце потенциала действия могут вызвать новое, так называемое ритмическое возбуждение (см. рис. 2.24).

Именно мембранный ток Im, создает возможность регистрации потенциалов действия с помощью внеклеточных электродов, поскольку такие электроды измеряют плотность тока во внеклеточном растворе. Внеклеточные микроэлектроды отводят от нервных клеток и волокон в ЦНС трехфазные «спайки», амплитуда которых пропорциональна мембранному току Im на рис. 2.22. В свою очередь ток Im во время распространяющегося потенциала действия пропорционален второй производной внутриклеточного потенциала от времени [16].

Факторы, определяющие скорость проведения.

Скорость проведения по нервному волокну можно определить путем сложных расчетов, зная зависимость ионных токов от потенциала и времени, а также условия, определяющие электротоническое распространение,–диаметр волокна, сопротивление и емкость мембраны. Результаты такого расчета близки к экспериментальным данным [16], что подтверждает справедливость ионной теории возбуждения и электротона. Здесь мы обсудим только качественные факторы, влияющие на скорость проведения.

Одним из таких факторов служит амплитуда входящего Na⁺–тока, поскольку чем больше ток после перезаряда мембраны при возбуждении, тем больше ток, который потечет через соседние, еще не возбужденные участки, и деполяризация этих участков произойдет быстрее. Входящий Na⁺–ток можно уменьшить путем снижения концентрации в растворе и путем усиленной инактивации Na⁺–системы, которая развивается при снижении потенциала покоя или воздействии местных анестетиков. При всех этих условиях скорость проведения потенциала действия снижается и в конечном счете проведение блокируется.

Электротоническое распространение мембранных токов также является очень важным для скорости проведения. Поскольку сопротивление и емкость элементарного участка мембраны практически одинаковы во всех возбудимых клетках, электротоническое распространение определяется главным образом диаметром волокна. Поверхность мембраны нервного волокна пропорциональна его диаметру, а площадь поперечного сечения волокна возрастает пропорционально квадрату диаметра. Поэтому при увеличении диаметра волокна продольное сопротивление его внутренней среды, определяемое площадью поперечного сечения, снижается относительно сопротивления мембраны. В результате электротонические токи распространяются на большее расстояние (увеличивается постоянная длины λ) и возрастает скорость проведения. Хотя с увеличением диаметра волокна емкость мембраны тоже возрастает пропорционально площади мембраны (что ведет к уменьшению скорости проведения), преобладает эффект снижения продольного сопротивления. В конечном итоге скорость проведения возрастает пропорционально корню квадратному из диаметра волокна. Это соотношение отражено и в табл. 2.1.

Проведение в миелинизированных аксонах. Благодаря особенностям своей структуры миелинизированные нервные волокна проводят потенциалы действия чрезвычайно быстро. Только очень короткие участки этих волокон, перехваты Ранвье, покрыты обычной клеточной мембраной. Участки между перехватами имеют многослойную миелиновую оболочку, которая значительно увеличивает сопротивление мембраны. Поэтому при сдвиге мембранного потенциала ток, по существу, не проходит

Рис. 2.23. Сальтаторное проведение. Справа: временной ход мембранного потенциала при регистрации в отмеченных стрелками точках вдоль миелинизированного аксона. Р₁, Р₂, Р₃–перехваты Ранвье. Распространение потенциала действия (см. сверху вниз) задерживается только в перехватах Ранвье (по [18])

через мембрану межперехватных участков, и потенциал действия от одного перехвата Ранвье к соседним перехватам распространяется через межперехватные участки электротонически и почти без декремента. Время проведения через межперехватные участки практически равно нулю–возбуждение перескакивает от одного перехвата к следующему. Такое сальтаторное проведение без потери времени на межперехватных участках иллюстрирует рис. 2.23. Задержка проведения происходит только в перехватах, где электротонический потенциал должен достичь порога и вызвать возбуждение. Мембрана перехвата специализирована для генерации возбуждения: плотность Na⁺–каналов здесь примерно в 100 раз выше, чем в немиелинизированных нервных волокнах. Высокая скорость проведения в миелинизированных участках обеспечивает возможность существования у позвоночных большого количества параллельных быстропроводящих нервных путей. В таких нервах все волокна со скоростью проведения выше 3 м/с являются миелинизированными; только очень медленные С–волокна (группа IV) немиелинизированы. Скорость проведения у беспозвоночных также может быть высокой–до 10 м/с, но за счет развития немиелинизированных «гигантских аксонов» диаметром почти 1 мм.

2.6. Генерирование импульсных разрядов при длительной деполяризации

Проведение по нерву происходит только в виде потенциалов действия; следовательно, вся информация, передаваемая по нервным волокнам на большие расстояния, должна быть представлена в «закодированной» форме, а именно частотой разряда потенциалов действия. В рецепторных мембранах, получающих сенсорные стимулы, развиваются медленные длительные изменения потенциала (рецепторные потенциалы); синаптические потенциалы нервных клеток тоже суммируются, вызывая медленные изменения мембранного потенциала. Чтобы по нервам передавалась информация, которая содержится в этих медленных сдвигах потенциала, они должны быть закодированы, т. е. преобразованы в разряды нервных импульсов определенной частоты.

Генерирование ритмических импульсов. На рис. 2.24 показано, как нервная клетка отвечает на раздражение током силой 1 и 4 нА. Включение слабого тока (1 нА) вызывает медленную электротоническую деполяризацию, которая нарастает, пока не достигнет плато (прерывистая линия). Однако еще до выхода на этот конечный уровень деполяризация достигает порога и инициирует потенциал действия. При реполяризации мембранный потенциал переходит за уровень покоя, образуя фазу гиперполяризации, а затем возобновляется медленная деполяризация; примерно через 0,5 с потенциал вновь достигает порога и возникает еще один потенциал действия. Этот цикл может повторяться до тех пор, пока протекает деполяризующий ток; стойкая деполяризация преобразуется в ритмический разряд потенциалов действия с частотой примерно 2 Гц. При более сильном токе, примерно 4 нА, происходят в принципе такие же процессы, как и при 1 нА, но скорость нарастания и амплитуда стационарной деполяризации (прерывистая линия) увеличиваются, и, следовательно, повышается частота потенциалов действия, которая составляет сначала 7 Гц, затем снижается до 4 Гц. Такое медленное падение частоты во время постоянного стимула является типичным и называется «адаптацией». Конечный эффект в обоих случаях состоит в том, что амплитуда стимулирующего тока (или стойкой деполяризации) кодируется в виде соответствующей частоты потенциалов действия.

Механизм генерирования импульсных разрядов.

Почти все возбудимые клетки генерируют разряды потенциалов действия в ответ на стойкую деполяризацию определенной величины. Частота их определяется скоростью нарастания деполяризации, начинающейся сразу после того, как будет достигнута

Рис. 2.24. Ритмический разряд импульсов, вызываемый длительным пропусканием стимулирующего тока. Вверху, пропускаемый через нейрон ток 1 нА вызывает электротонический деполяризующий потенциал, который достигает стационарного уровня около 20 м В (прерывистая линия), если не превысит порога генерации потенциала действия. Ритмическое воспроизведение потенциалов действия продолжается в течение всего периода пропускания стимулирующего тока. Внизу: стимулирующий ток более высокой амплитуды вызывает электротонический потенциал, который достигает уровня почти 0 мВ (прерывистая линия), если только не произойдет запуск высокочастотной серии потенциалов действия

максимальная реполяризация мембраны после потенциала действия. Быстрая реполяризация обеспечивается нарастанием К⁺–тока, который начинается с некоторой задержкой при деполяризации (см. рис. 2.7 и 2.12). Когда после реполяризации мембраны этот ток прекращается (тоже с задержкой), мембранный потенциал под влиянием пропускаемого тока (рис. 2.24) вновь смещается к уровню деполяризации (прерывистая линия), при котором происходит генерирование потенциала действия. Однако такой задержанный К⁺–ток (I_KЗ) помогает генерированию ритмических потенциалов действия только в ограниченном диапазоне деполяризации, и частота возникающих потенциалов действия может изменяться лишь в небольших пределах. Те области мембраны клетки, которые должны эффективно осуществлять кодирование деполяризации в ритмические потенциалы действия, обычно содержат К⁺–каналы другого типа, проводящие быстроинактивирующиеся токи I _KA. На рис. 2.25 изображен временной ход обоих компонентов К⁺–тока. I_KЗ регистрируется с задержкой после фаз де– и реполяризации. отличается тем, что после его возникновения в результате деполяризации он вновь быстро инактивируется, подобно Nа⁺–току. I_KA не может снова активироваться до тех пор, пока не произойдет кратковременная гиперполяризация

Рис. 2.25. Участие компонентов калиевого тока в генерировании ритмического импульсного разряда. Вверху: потенциал действия, запускаемый током 1 нА (так же, как на рис. 2.24). Внизу: компоненты тока, вызываемого деполяризацией,–входящий натриевый ток I_Na, задержанный неинактивирующийся выходящий калиевый ток и быстроинактивирующийся калиевый ток (по [10] с изменениями)

мембраны; он начинается во время быстрого спада I_KЗ после максимальной реполяризации; в это время I_KA предотвращает слишком быструю деполяризацию и таким образом снижает частоту импульсного разряда [10]. Этот механизм расширяет диапазон, в пределах которого частота потенциалов действия может изменяться в зависимости от уровня стационарной деполяризации.

Во время продолжающегося стимула нередко наблюдается снижение ритма высокочастотных разрядов потенциалов действия и их полное прекращение с возобновлением через некоторое время. В результате разряды приобретают форму отдельных вспышек. Такие вспышки образуются при участии еще одного типа –каналов –так называемых –активируемых К⁺ –каналов. Во время потенциала действия в клетку поступает, несколько увеличивая внутриклеточную концентрацию Са²⁺ , [Ca²⁺]_i. Повышение [Ca²⁺]_i активирует К⁺–каналы определенного типа, вызывая устойчивое увеличение входа K⁺. Благодаря этому усиливается реполяризация, что приводит в конечном итоге к прекращению разряда импульсов. Затем [Ca²⁺]_i возвращается к норме с помощью различных транспортных процессов и разряд начинается снова.

Сочетание деятельности разных типов К⁺–каналов в данном случае служит примером того, как многообразие ионных каналов обеспечивает специфические функции определенных типов клеток и областей клеточных мембран. Наличие различных типов Са²⁺–каналов тоже создает возможности разнообразных форм возбуждения.

2.7. Литература

Учебники и руководства

1. Alberts В., Bray D., Lewis J., RaffM., Roberts К., Watson J. D. Molecular biology of the cell. New York and London, Garland Publishing Inc., 1983.

2. Cooke I., Lipkin M. Cellular Neurophysiology, a source book. New York, Holt, Rinehart and Winston, 1972 (collection of important original papers).

3. Hille B. Ionic channels of excitable membranes. Sunder–land. Mass., Sinauer Assoc., 1984.

4. Hoppe–W., Lohmann W., Marki H.. Ziegler H. (eds.). Biop–hysik. Berlin, Heiderlberg, New York, Springer, 1984.

5. Kandel E. Rюб., Schwartz J. H. (eds.). Principles of neural science. New York, Amsterdam, Oxford, Elsevier, 1985.

6. Kuffler S. W., Nicholls J. G., Martin A. R. From neuron to brain, Second Edition Sunderland, Mass., Sinauer Associates, 1984.

Оригинальные статьи и обзоры

7. Adrian R. H. The effect of internal and external potassium concentration on the membrane potential of frog muscle. J. Physiol. (Lond.), 133, 631 (1956).

8. Aldrich R. W. Voltage dependent gating of sodium channels: towards an integrating approach. Trends Neurosci., 9, 82–86 (1986).

9. Armstrong С. M. Sodium channels and gating currents. Physiol. Rev., 61, 644–683 (1981).

10. Connor J. A., SlevensC.F. Inward and delayed outward membrane currents in isolated neural somata under voltage clamp. J. Physiol. (Lond.), 213, 1–19 (1971).

11. Gasser H. S., Grundfest H. Axon diameters in relation to the spike dimension and the conduction velocity in mammalian A–fibers. Amer. J. Physiol., 127, 393 (1939).

12. HamillO.P., Marly A., Neher E., Sakmann В., Sigworlh F. J. Improved patch clamp techniques for high resolution current recording from cells and cell–free membrane patches. Pflugers Arch., 391, 85–100 (1981).

13. Heinemann U., Lux D. Ionic changes during experimentally induced epilepsies. In: Progress in Epilepsy, R. C. Rose, Ed., London, Pitnam Medical, p. 87–102 (1983).

14. Hille В. Ionic channels in exitable membranes. Biophys. J., 22, 283–294 (1978).

15. Hodgkin A.L„ Huxley A.F. The dual effect of membrane potential on sodium conductance in the giant axon of Loligo. J. Physiol. (Lond.), 116, 497 (1952).

16. Hodgkin A. L.. Huxley A.F. Quantitative description of membrane current and its application to conduction and excitation in nerve. J. Physiol. (Lond.), 117, 500 (1952).

17. Hodgkin A.L., Rushton W.A. H. The electrical constants of crustacean nerve fibre. Proc. roy. Soc. B, 133, 444 (1946).

18. Huxley A. F., Stampfli R. Evidence for saltatory conduction in peripheral myelinated nerve fibres. J. Physiol. (Lond.), 108, 315 (1949).

19. Kameyama M., Hofmann F., Trautwein W. On the mechanism of b–adrenergic regulation of the Ca channel in the guinea pig heart. Pflugers Arch., 405, 285–293 (1985).

20. Katz B. Electrical properties of the muscle fibre membrane. Proc. roy. Soc. В., 135, 506 (1948).

21. Lauger P. Ionic channels with conformational substates. Biophys. J., 47, 581–590 (1985).

22. Lloyd D. P. С., Chang H. T. Afferent fibres in muscle nerves. J. Neurophysiol, 11, 199 (1948).

23. Meves H. Inactivation of the sodium permeability in squid giant nerve fibres. Prog. Biophys. Mol. Biol., 33, 207–230 (1978).

24. Neher E., Sakmann В., Steinbach J. H. The extracellular patch clamp: A method of resolving currents through individual open channels in biological membranes. Pilugers Arch., 375, 219–228 (1978).

25. Neumcke В., Schwarz W., Stampfli R. Block of Na channels in the membrane of myelinated nerve by benzocaine. Pflugers Arch., 390, 230–236 (1981).

26. Neumcke В., Stampfli R. Heterogeneity of external surface charges near sodium channels in the nodal membrane of frog nerve. Pflugers Arch., 401, 125–131 (1984).

27. Noble D. Applications of Hodgkin–Huxley equations to excitable tissues. Physiol. Rev., 46, 1 (1966).

28. Rang H. P., Rilchie J. M. Electrogenic sodium pump in mammalian non–myelinated nerve fibres and its activation by various external cations. J. Physiol. (Lond.), 196, 183 (1968).

29. Ruch Т. С., Patton H. D. Physiology and Biophysics. Philadelphia, Saunders, 1966.

30. Schwarz W., Pallade P. Т., Hilie B. Local anesthetics: Effecl of pH on use–dependent block of sodium channels in frog muscle. Biophys. J., 20, 343–368 (1977).

31. Sigworth F.L., Neher E. Single Na⁺ channel currents observed in cultured red muscle cells. Nature (Lond.), 287 447–449 (1980).

32. Trautwein W., Pelzer D. Voltage dependent gating of single calcium channels in cardiac cell membranes and its modulations by drugs. In: Calcium physiology, D. Mamie Editor. Berlin, Heidelberg, New York, Toronto, Springer (in press), 1986.

33. Ulbricht W. Kinetics of drug action and equilibrium results at the node of Ranvier. Physiol. Rev., 61, 785–828 (1981)

34. While M. W., Bezanilla В. Activation of squid axon K⁺ channel. Ionic and gating current studies. J. Gen. Physiol. 85, 539 554 (1985).

35. Quandt F. N.. Yeh J.Z., Narahashi T. All or none block of single Na⁺ channels by tetrodotoxin. Neurocsi. Lett., 54 77 83 (1985).